Основы геномики для чайников или как читать результаты аутосомного тестирования

Начну несколько издалека — с современного дизайна биочипов панелей снипов. Нужно вспомнить, что в своей основе биочипы-платформы, используемые в целях коммерческого тестирования в 23ия и ФТДНА представляют собой модифицированные варианты стандартных платформ Иллюмина (23ия) и Аффиметрикс (если я не ошибаюсь, биочип ФТДНА разработан на основе этой платформы). Дизайн обеих платформ разрабатывался из целей, далеких от задач ДНК-генеалогии, или скажем, ДНК-криминалистики (хотя авторы концепции SNP-генотипирования и предполагали смежные задачи, — например, установление личности индивида). Перед разработчиками дизайна биочипов и новых методов снип-генотипирования ставилась четкая задача — разработать платморфму снип-тестирования, совместимую с  двумя основными методами медицинской генетики
Это метод выявления QTL (выявление участков ДНК, сцепленных с генами, обуславливающими тот или иной фенотипический признак), а также метода генетической ассоциации генетического сцепления или неравновесного сцепления генов ,  когда генетические (фенотипические) признаки двух групп  сравниваются напрямую с ДНК-сиквенсами представителей этой группы.

Поскольку снипы обычно представляют собой (за исключением редких аллелей  с частотой двух аллей) вариацию двух аллелей, т.е различаются всего на один олигонуклеотид, то существенной особеностью сиквенсирования на биочипах является проблема оптимизировании недостаточной гибридзации проб, а также потенциальная возможность того, что таргетная ДНК может гибридизировать несовпадающие снипы. Эта особенность приводит к тому, что результаты генотипирования на биочипах  довольно часто дают болшой процент менделевских ошибок, т.е тех случаев когда у ребенка присутстовал аллель, который он не мог унаследовать от родителей (за исключением редкого явления дисомии). Те, кто пользовались утилитой Дэвида Пайка или посылали свои данные Леону (napobo3), могли сами убедиться в этом на примере сравнения своих данных с данными родителей.

Это был первый тип инструментальных погрешностей, вносящих неопределенность в оценку близости или дальности родства. Он связан собственно с процессом гибридизации ДНК. Второй тип инструментальных погрешностей связан собственно с процессом генотипирования индивидуального ДНК. Для генотипирования на платформе Иллюмины испольузется программа GenCall, который по байесовской вероятности определяет кластер, к которому относиться тот или иной локус анализируемого ДНК. Многие из тех форумчан, кто работал со своими данными от 23ия, наверняка видел т.н «no-call» генотипы (-) в raw data. «No-call» означает, что программа не смогла определить генотип (или вернее, кластер к которому относиться анализируемый локус ДНК).

Наличие этих «пустых» генотипов также вносит свою лепту в увеличение т.н инструментальных погрешностей.

Забудем на время о существенных инструментальных погрешностях и перейдем к тому, как 23ия представляет генотипы rs-локусов. Если Вы скачаете файл с генотипами, то там достаточно стандартное обозначение — сначало идет название локуса; затем хромосома, на которой находится локус, физическая дистанция, и наконец — две последние колонки (в NRY и митохондрионе — одна) с генотипом. Генотип содержит следущие обозначения -олигонуклеотиды A,G,C,T, делеции (D), инсерции (I) и no-calls (-).

В качестве примера

Цитировать

rs759691   3   10502762   CC
rs7619994   3   10502775   AA
rs808933   3   10503910   CC
rs17032981   3   10504067   GG
rs17032984   3   10504069   GT
rs2430890   3   10507556   CT
rs799320   3   10508302   TT
rs6807064   3   10510771   CT
rs11719906   3   10511005   CT
rs9873870   3   10514482   CT
rs6442176   3   10520676   CT
rs4234497   3   10528419   CT
rs7629412   3   10528635   CC
rs882527   3   10531104   —

Генотип здесь определяется по локусам, по-этому невозможно сказать, какой именно аллель достался от матери, а какой -от отца.

Неверно полагать, что нижеприведенный вариант (жирным обозначены аллели унаследованные, например, от матери) единственно возможный

Цитировать

rs17032981   3   10504067   GG
rs17032984   3   10504069   GT
rs2430890   3   10507556   CT
rs799320   3   10508302   TT
rs6807064   3   10510771   CT
rs11719906   3   10511005   CT
rs7629412   3   10528635   CC
rs882527   3   10531104   —

Варианты возможное менделевское наследование аллелей включает в себя все возможные с точки зрения комбинаторики варианты.

Например, вот такой вариант

Цитировать

rs17032981   3   10504067   GG
rs17032984   3   10504069   GT
rs2430890   3   10507556   CT
rs799320   3   10508302   TT
rs6807064   3   10510771   CT
rs11719906   3   10511005   CT
rs7629412   3   10528635   CC
rs882527   3   10531104   —

Или  такой

Цитировать

rs17032981   3   10504067   GG
rs17032984   3   10504069   GT
rs2430890   3   10507556   CT
rs799320   3   10508302   TT
rs6807064   3   10510771   CT
rs11719906   3   10511005   CT
rs7629412   3   10528635   CC
rs882527   3   10531104   —

Казалось бы достаточно протестировать одного из родителей, и Вы сможите реконструировать «цепочку снипов» (по сути гаплотип), доставшийся Вам от этого родителя. Однако существует такое явление, как дисомия. Однородительская дисомия, то есть наследование обеих копий целой хромосомы или ее части от одного родителя (при отсутствии соответствующего генетического материала от другого родителя), является исключением из менделевских принципов наследования.
Однородительская дисомия была описана при муковисцидозе , когда оба мутантных аллеля наследовались от одного родителя. В таких случаях дисомия имитирует аутосомно-рецессивное наследование.

Это —третий тип погрешностей, на этот раз биологического характера

Таким образом, все вышеназванные погрешности биологического, биохимически-инструментального и чисто инструментального характера, приводят исследователей к необходимости фазирования биаллельных сегментов пар хромосом.

Дальше -про фазирование.

Наверное, перед тем как не мудрствуя лукаво приступить к пояснению фазирования данных 23ия, нужно еще раз вкратце напомнить, по какому алгоритму идет предсказание степени родства в 23ия.

На этот раз, буду краток (с).

Алгоритм 23ия выведен исключительно путем компьютерног моделирования. Бралось некоторое количество генотипных данных реально протестированных в 23ия людей. Эти данные искуственно скрещивались с учетом некоего усредненной величины параметра рекомбинации на один мейоз (или, как у нас принято выражаться, генеалогического поколения), тем самым появились искуственные «геномы» (назовем их так для простоты).
Затем по методу MCMC моделировалась искусственная генеалогия потомков «гибридных геномов» (что-то вроде семьи Менделя), т.е случайным образом (по методу Монте-Карло) генерировалась некая марковская цепь генеалогических поколений (последовательность поколений, в которой последующее состояние зависит только от настоящего состояния и не зависит «от генеалогического прошлого») разной длины — 4,5,8, 11 и т.д поколений.  «»Геномы» всех гибридных геномов сравнивались на предмет а) % общего ДНК b) генетической дистанции сегментов IBD (HIR, или как у нас принято УПСов) выраженной в сM (сентиморганах) и с) количества снипов в этих сегментов.

По этим параметрам (а,b,c) УПСЫ разбивались на кластеры в зависимости от дистанции генома-потомка от генома-предка. Затем произвели своего рода метафорическую процедуры «сверку попаданий сегментов»  в интервалы смоделированного родства. Именно таким образом, с помощью моделирования, создатели алгоритма RF получили пороговые количества снипов и генетической дистанции (в сМ) как для всего диапозона RF, так и для каждого интервала родства (например, 3d-10th cousins).

Эти три параметра и используются в RF для оценки удаленности генетического родства или генеалогической дистанции.

Я не буду останавливаться здесь на подробной критике алгоритма. Скажу только, что несмотря на всю привлекательность дизайна MCMC-алгоритма RF , его главный недостаток -это

1)допущение случайного характера «скрещивания» (пардон за вульгаризм) среди некой метапопуляции,
2)независимость характера скрещивания от предыдущего типа скрещивания,
3) пренебрежение гомозиготностью и т.д.

Не говоря уже об использовании некой усредненной величины рекомбинации и игнорирование естестественного отбора, приводящего к тому, что многие участки хромосом  из-за сильного генетического сцепления остаются в нерекомбинантном состоянии на протяжении веков.

Каждый генеалог знает, что матримониальная стратегия (говоря простым биологическим языком, структура скрещивания) генеалогических групп  не носит случайный характер. Выбор партнеров был обусловлен происхождением, классовой принадлежностью, патрилокальностью, а также религиозными, политическими и идеологическим запретами.

Каждый генеалог и социальный антрополог знает, что структура брачных связей в кланновых и патриархальных обществах в-основном обусловлена структурой предыдущих брачных связей (вспомните хотя бы т.н. брачные обыски, в ходе которых проверялось,не состояли ли брачующиеся в родстве). Конечно же были и исключения, но они статистически пренебрежимы.

Каждый генетик знает, что в оседлых популяциях постепенно возрастает гомозиготность, что ведет к увеличении однородности и генетической близости индивидов внутри популяции.

Каждый генетик знает, что величина рекомбинации очень сильно варируется -в 10 и 100 раз — в зависимости от участка хромосом

Каждый генетик знает, что в оседлых популяциях постепенность возрастает гомозиготность (что есть логичное последствие инбридинга), что ведет к увеличении однородности и генетической близости индивидов внутри популяции.

Каждый генетик знает, что существуют геномные регионы — например MHC, со столь сильным сцеплением, обусловленным отбором, что эти участки могут оставаться идентичными у двух индивидов, даже если их общий предок жил тысячелетие назад

Итак, что имеем в сухом остатке:

1) наличие трех типов «инструментальных» погрешностей в данных генотипов от 23ия
2) сухую абстрактность метода оценки степени родства в алгоритме РФ от 23ия

К этому можно добавить очевидное наличие сегментов УПС с совпаденцами, увеличивающихся в размере при поколенном переходе от родителей к детям, хотя по логике, они должны постепенно затухать, уменьшаясь в размерах. Самое наличие таких сегментов — великолепная иллюстрация кумулятивного действия эфектов возрастания гомозиготности и увеличания фонового уровня «скрытого родства» (на профессиональном слэнге генетиков -«hidden relatedness» ).

Это наводит на очевидную мысль, что указание (в РФ алгоритме анализирующем нефазированные данные) на 5-6-юродную степень родства пуштуна и скажем, литовца может с абсолютно одинаковой степенью вероятности (50% на 50%) означать как наличие «афганского» следа в родословной литовца (или литовского следа — у пуштуна), так и очень далекое родство, близкое к случайному совпадению.

Можно ли строить гипотезы на столь шаткой почве? Вряд ли.

На самом деле сам процесс фазирования генотипов подразумевает выявление (с высокой апостериорной вероятностью) гаплотипной фазы с учетом именно семейных данных. Обычно в генетических штудиях — как популяционных (реже),так и медгенетических (намного чаще) — работают с трио (генотипы матери-отца-ребенка). Но именно коммерческое генотипирование открывает более широкое поле деятельности для фазирования — получения более-менее однозначного гаплотипа с более-менее однозначной генеалогией.

По моим скромным наблюдениям, некоторые клиенты 23ия протестировали уже целые кланы своих родственников по 10-20 человек (отцов, матерей, братьев, сестер, племянников, дедов, бабок, детей, двоюродных, троюродных и т.д человек). Фазирование генотипных данных больших семейст позволило бы создать, выражаясь программистским языком, уникальную семейную библиотеку гаплотипов с четкой ДНК-генеалогической структурой наследования. По мере увеличения таких семейных библиотек и все большему охвату масс, можно было бы сравнивать эти гаплотипы уже на уровне семейств/кланов и выстраивать наиболее вероятные с точки зрения ДНК-генеалогии филогенетические кластеры.

Пока же все остается на интуитивно-гадательном уровне.

«Генеалогические» и «случайные» совпадения сегментов хромосом

Периодически на разных форумах (в том числе и на этом) подымается на повестку дня вопрос о том, являются ли сегменты полуидентичного совпадения (НIR) сравниваемых хромосом общими сегментами в смысле общности генеалогического происхождения, — или же эти наличие HIRs (УПСы) является случайным.

Для удобства изложения заменю понятие HIR (УПС) на более общепринятые в науке понятие IBD (сегмент, идентичный по происхождению) и понятие IBS (сегмент, идентичный по сходству). Последний в слэнге молгеновцев именуется лжеупсом.

Существуют ли статистические методы для определения характера совпадающего сегмента? Можно ли определить, какой сегмент достался от общего предка, а какой -продукт случайного совпадения?

Оказывается,теоретически можно. В любопытной статье «Shared genomic segment analysis. Mapping disease predisposition genes in extended pedigrees using SNP genotype assays» было показано, что независимое от популяционного «шума» распределение сегментов IBD  соответствует Пуассоновскому распределению со средним значением:


Авторы статьи провели любопытный анализ эмпирического распределения IBD сегментов у 8 генеалогически родственных лиц и сравнили его с распределением IBS, сгенерированных случайным образом.

Соотношение проиллюстрировано графиком: сплошная линия соответствует распределению сегментов IBS, точечная линия распределению сегментов IBD. Пунктирная линия -смеси распределений сегментов ложнопозитивных совпадений IBS и истинно генеалогических IBD.

Благодаря новой фиче сайта Gedmatch (c) J.Olson (за что ему низкий поклон лично от меня), позволяющей сравнивать отдельные «геномы» (в данном со всей базой (660 геномов) в мастшабах сегментов «размером» более 1,5 и 10 сМ, я смог проверить выводы авторов на более объемном материале (совокупный размер совпадающих сегментов дан также в сентиморганах сМ).

Я построил гистограммы  (на график обозначена синим цветом) частоты распределения идентичных сегментов того или иного размера, а также график куммулятивного распределения частот (красная линия).

Чуть позже прокомментирую результаты.

Начну с аутосомных хромосом.

Начну с самого простого графика распределения максимальных совпадающих  сегментов.
Простого в том смысле, что здесь показано распределение не суммы сегментов, а единичных сегментов наибольшего размера.

Являются ли единичные сегменты общими по происхождению, или же это случайное совпадение?

Визуально гистограмма распределения крупнейших сегментов близка к виду пуассоновского распределения (теоретически это можно проверить тестом Холмогорова-Смирнова, но я его не проводил). Поэтому можно предположить правильность выводов авторов статьи, упомянутой в первом посте темы

Каковы эмпирические свойства данного распределения?
Пик «колокола» распределения приходится на сегменты размером 5.424 сM (красный столбик гистограммы), что, видимо, неслучайно. Напомню, что 5.5 сM -это нижнее пороговое значение, при которых  алгоритм 23andme квалифицирует сегмент как «генеалогический» (IBD), а его обладатель — как «генетический кузен» в базе данных Relative Finder. Обычное обладатели таких общих сегментов (5.5 сM) не высвечиваются в списке RF-кузенов вплоть до тех пор, пока Вы не зашарите свой геном с ними.
Любопытна линия кумулятивного распределения, отсекающая примерно 60% таких сегментов. Интуитивно можно предположить, что примерно  60% таких единичных сегментов размером 5-5.5 сM не являются генеалогическими сегментами в плане наличия недавнего общего предка.

Этот вывод неплохо согласуется с мнением Энн Тернер, которая считает, что примерно 2/3 являются случайными совпадениями (IBS -idemtical by state).
Любопытна кривая кумулятивного пуассоновского распределения крупнеших сегментов. В левой своей части она визуально похожа на крутую сплошную линию распределения IBS («ложных сегментов») из процитированной статьи. Начиная примерно с единичных сегментов размером 7-8 сM, линия визуально приобретает характер прерывистой линии распределения с кумулятивным процентом 90-100% (из той же статьи). По мнению авторов статьи, подобное распределение общих сегментов характерно для тех случаев, когда распределение «случайных» IBS совпадений на кладывается на распределение «генеалогических» IBD сегментов.

Наблюдаемая картина неплохо согласуется с дефолтным порогом «генеалогических совпадений» в 23andme (7 cM), при котором «генетические кузены» (с сегментами => 7сM)  показываются в списке кузенов по умолчанию. Хотя по эмпирическим данным этот слегка смещен в сторону 9 сM.

Следущий график должен быть интересен как тем, кто проходил мульти-снип тестирование в 23ия, так и клиентам FTDNA, тестировавшимся в FamilyFinder.

Здесь показано распределение суммы идентичных сегментов, каждый из которых больше 10 сM.
Левая часть графика представляет собой «нулевую» линию вплоть до 10 сM, что логично, ибо согласно условиям, минимальный размер идентичных сегментов должен быть равен 10 сM. Далее хвост кумулятивного распределения плавно возрастает в интервале между 20 сМ -30 сМ, после чего приближается к 100% (подобно пунктурной линии из обсуждаемой статьи).
На основании наблюдаемой картины можно сделать предположение, что при наличии общей суммы идентичных сегментов, выраженной в сМ и большей чем 20 сМ, и  минимальном размере каждого отдельного сегмента 10 сМ, каждый из них с высокой степенью вероятности является идентичным по происхождению (генеалогии) сегментом.

Редактировать сообщение

Третий график будет особенно интересен клиентам FamilyFinder-FTDNA, т.к. там считают общую сумму сМ, в том числе и для сегментов, каждый из которых больше 5 сM.

Визуально правая часть гистограммы распределения сегментов > 5 cM наиболее похоже на логнорма?льное распределе?ние, что в принципе понятно, т.к. если случайная величина имеет логнормальное распределение, то её логарифм имеет нормальное распределение.

Ненулевой пик гистограммы приходится на интервал сегментов между 7-8 сM, т.к эта часть гистограммы описывается пуассоновским распределением, и в этом случае сегменты представленны не суммой, а единичным идентичным сегментом размером в 7 — 8 сM.

Линия кумулятивного распределения носит характер линии IBS распределения примерно до интервала сегментов размером 30-35 сегментов, что означает, что кроме единичных сегментов, большинство совокупных сегментов состоят из множества IBS сегментов. Признаки смешенного распределения IBS+IBD сегментов начинаются с интервала 35 сМ. Это означает, что при общей сумме сегментов (> 5 cM ), равной 35 сМ минимум один совпадающий сегмент будет общим по происхождению.

 

В принципе эти выводы подтверждают выводы из приведенной статьи

Expected distributions of IBD chromosomal segments between pairs of
individuals. 
(A) The process underlying the pattern of IBD segments. Two homologous
autosomal chromosomes are shown for two parents, each colored differently. Meiosis and
recombination occurs and two sibling offspring inherit recombinant chromosomes (just
one crossover per homologous pair for each meiosis event is depicted, marked by an ‘X’).
For some segments of the chromosome in question, the siblings share a stretch that was
inherited from one of the four parental chromosomes. The three IBD segments are
identifiable as regions that share the same color (boxed and marked at right by black
bars). The siblings mate with unrelated individuals and the offspring each inherit an
unrelated chromosome (tan or gray) and one that is a recombinant patchwork of the
grandparental chromosomes. These first cousins share one segment IBD at this
chromosome (red, boxed). 


(B) The number of segments that a pair of individuals shares
IBD, across all chromosomes, is approximately Poisson distributed with a mean that
depends on the degree of relationship d between the individuals (d = 2, 4, 6, 8,
corresponding to siblings through third cousins). 

(C) The lengths of the IBD segments are
approximately exponentially distributed, with mean length depending on the relationship
between individuals (theoretical distributions shown for d = 2d, 4th, 6th, 8th cousins).