2014 год — год палеогенетики и эпигенетики

Оглядываясь назад на события и открытия, коими в уходящем 2014 году ознаменовалась область исследований генетики человека, можно смело сказать что уходящий год был годом прорыва в двух принципиально различных направлениях — в палеогенетике, изучающей геномы популяций древних людей прошлого, и  в эпигенетике,  с помощью которой можно прогнозировать будущее (здоровье и качество жизни) отдельных людей.


Палеогенетика

В самом начале 2014 года, на руках немногочисленных исследователей  палеогеномов было менее десятка древних геномов человека, опубликованных в предыдущие года. К концу 2014 года опубликован ряд работ, посвященных попыткам генотипирования останков древних людей — от живших несколько тысячелетий назад до «усть-ишимца» с предположительным возрастом около 45 тысяч лет, неандертальцев и «денисовки». Количество таких расшифровок растет все быстрее, что не может не вызывать оптимизма.  Вторая половина 2014 года особенно примечательна как количеством подобных публикаций, так и числом полных геномных NGS-сиквенсов древних людей, размещенных в публичных репозиториях (банках геномных данных). Так, в сентябре в Nature была опубликована окончательная версия работы Lazaridis et al. 2014  «Ancient human genomes suggest three ancestral populations for present-day Europeans». Работа получила широкое освещение в СМИ, поскольку аналитическая выборка сэмплов в этом исследовании включала значительное количествао заново генотипированных (на чипе Affymetrix HumanOrigin) образцов ДНК из древних палеолитических стоянок Сибири (Афонтова Гора, Малта), представителя древней индейской культуры Кловис и палеоэскимоса Cаккак. В работе был представлен  целый  ряд образцов древней ДНК представителей европейских мезолитических и неолитических культур, опубликованных в более ранних работах 2012-2014 годов: Skoglund et a. 2014 «Genomic Diversity and Admixture Differs for Stone-Age Scandinavian Foragers and Farmers»(шведские земледельцы и охотники собиратели эпохи неолита); Olalde et al. 2014 «Derived immune and ancestral pigmentation alleles in a 7,000-year-old Mesolithic European» (дДНК мезолитического населения Иберийского полуострова) и т.д.

Опубликованные геномы так и остались бы достоянием небольшой группы ученых, и по-прежнему бы использовались бы только для сравнения с абстрактными и анонимизрованных данными референсных популяций человека, если бы усилиями пары любителей (прежде всего усилиям Чандракумара) палеогеномы не были преобразованы в привычные и удобные для популяционного анализа форматы  BAM, VCF и Plink binary, а также в стандартный формат геномных данных от FTDNA. По своей сути, преобразование состояло в сложной процедуре сборки генома из библиотек коротких геномных ридов (в формате sra., в котором эти риды хранятся в репозиториях крупных баз геномных данных). Полученные сборки геномов в формате sam/bam cравниваются с референсным геномом человека, и отличающиеся одиночные нуклеотидные полиморфизмы сохраняются в VCF файл. Здесь нужно помнить о том, что в этой процедуре не учитывался параметр качества сиквенса PHRED score. Традиционно рекомендуется использовать только те базовые пары, PHRED score которых превышает 30, т.е чья точность определения составляет 99.9% (или 1 ошибка на 1000 базовых пар). Кроме того, в этой процедуре разработчик не учел влияние постмортальных изменений ДНК. Cледует помнить, что ДНК, как и любая биомолекула, способна вступать в химические реакции с окружающим миром, тут-то и появляются различные модификации нуклеотидов (особенно по краям фрагментов древней ДНК). Наиболее частая постмортальная мутация — дезаминирование цитозинов (C), приводящая к возникновению урацилов (U) в последовательности древней ДНК, которые при проведении ПЦР многократно копируются «бездушным» ферментом ДНК-полимеразой как тимин (Т). Именно по этой причине, при оценке достоверности снипов в полученных из палеогеномов вариантах особое внимание требуется уделять транзициям C->T и  G->A.  Если при подсчете вариантов окажется, что такие транзиции встречаются чаще ожидаемого, то можно сделать вывод о существенном повреждении палео-ДНК.  И хотя по причине игнорирования этих ограничений, автором было получено большое количество снипов, в некоторых случаях, например при объединении полученных данных NGS c данными генотипирования с помощью классических технологий миркочипов, использование таких данных может существенно уменьшить качество интерпретации.

Тем не менее, благодаря этим усилиям, и не в меньшей степени, благодаря соотрудничеству с порталом Gedmatch и компанией  FTDNA, большинство клиентов ведущих компаний на рынке персональной геномики и генетической генеалогии (таких как 23andme, и FTDNA) могут сравнить свои данные с данными древних геномов либо путем сравнения частото аллелей, либо посегментно сравнивая свои хромосомы с гомологичными хромосомами древних геномов.  Более того, Феликс Чандракумар пошел дальше и разместил 10 наиболее качественных палеогеномов (т.е палеогеномов с наибольшим числом перекрывающихся разными микроматрицами снипов) на FTDNA. Таким образом, с помощью сервиса MyOrigins FTDNA, исследователи могут установить распределение «этно-популяционных составляющих» или «предковых этнопопуляционных компонентов» в этих древних геномов. Нужно помнить, конечно же, что в случае с наиболее древними геномами (геномами неандертальца, усть-ишимца и т.д.) полученное распределение более молодых компонентов (полученных из современных популяций) нельзя интерпретировать буквально.


Эту замечательную функцию дополняют калькуляторы Eurogenes, благодаря которым любой интересующийся человек может посмотреть, какой процент его/ее генома приходится на тот или иной древний геном. Для людей, озабоченных вопросами анонимности, Феликс разработал отдельное десктопное приложение  — калькулятор древней ДНК. Этот калькулятор  показывает, какой процент ДНК (составных сегментов) аутосомной ДНК клиента попадает в каждый из 30 образцов древней ДНК . Другими словами, он показывает  процент общих предков в сравнении современного ДНК и палеоДНК.

Подводя итоги года, можно сказать, что в области изучения древней ДНК все ожидания были оправданы.


Эпигенетика

Под эпигенетикой обычно понимают область знаний о совокупности свойств организма, которые не закодированы непосредственно в геноме, но могут и должны передаваться по наследству.Эпигенетика может быть определена как изучение механизмов контроля активности генов во времени и пространстве в процессе развития сложных организмов. К настоящему времени обнаружены и описаны различные механизмы контроля активности генов, однако в уходящем 2014 году особое внимание ученые уделяли  изучению одного из таких механизмов  — ферментативному (энзиматическому) метилированию самой генетической матрицы, то есть ДНК.

Метилирование — это изменение молекулы ДНК путем присоединения метильной группы (-СH3) к нуклеотиду C, причем необходимо, чтобы за С следовал нуклеотид G. Последовательность нуклеотидов -CG- называется СpG динуклеотидом, или CpG сайтом. Метилирование происходит не во всех клетках одновременно, поэтому говорят о проценте метилирования определенного CpG сайта.метилирование ДНК ощутимо сказывается на её взаимодействии (связывании) с различными белками. Во многих случаях метилирование по цитозиновым остаткам препятствует связыванию специфично реагирующих с ДНК ядерных белков (факторов), которые, собственно, и осуществляют разные генетические процессы, в том числе транскрипцию, репликацию и репарацию.Как известно, метилирование играет важнейшую роль в механизме экспрессии (т.е качественном и количественном проявлени) генотипа в фенотип. оказано, что с изменением профиля метилирования связаны такие заболевания, как различные виды рака, диабет первого и второго рода, шизофрения и т.д. Поэтому важно уметь анализировать профиль метилирования генома, и здесь перед энзимологией расскрываются огромные перспективы. Например, в 2014 году компания «СибЭнзайм» открыла новый фермент, на базе которого разработали новый метод детекции. Он позволяет определять, включен или выключен интересующий вас ген — э то управляющий механизм в организме, именно отключение отдельных генов ученые связывают с развитием рака:

С технической точки зрения, изучение метиляции ДНК происходит с использованием модифицированного варианта ChiPSeq (это комбинированный вариант иммунопреципитации хроматина (ChIP) и высокоэффективного секвенирования ДНК для определения участков связывания ДНК и белков). Не вдаваясь в биолого-химические подробности этого модифицированного метода, его можно кратко описать следующим образом. Каждый CpG сайт измеряется с помощью двух флуоресцентных проб. Флуоресцентный сигнал проб пропорционален соответственно количеству метилированных и неметилированных CpG сайтов в тестируемом образце.  Полученные данные образуют собой профиль метилирования, который удобно сравнивать с различными референсными образцами. Как уже говорилось выше, этот профиль можно использовать не только для медицинских целей (например, для изучения эпигенетических факторов развития различных заболеваний), но и для более общих целей. В недавном исследовании, проведённом специалистами из Калифорнийского университета (UCLA), выявило биологические часы, встроенные в геном человека и оно впервые определило, что внутренние часы в состоянии точно оценить возраст различных человеческих органов, тканей и клеток. Исследователи обратили свое внимание на метилировании – естественном процессе, изменяющем химический состав ДНК. Он изучил 121 набор данных, собранных ранее исследователями, изучавшими метилирование здоровых и раковых тканей человека. Проанализировав информацию по 8000 образцов из 51 типа тканей и клеток со всего тела, исследователи смогли определить, как возраст влияет на уровни метилирования с рождения до 101 года. Он определил, что метилирование работает на 353 участках ДНК, которые изменяются с возрастом. Таким образом, профиль метилирования ДНК представляет собой наиболее надежную метрику для расчетов биологического возраста как отдельных органов, так и всего организма.

Принимая это во внимание, можно сказать что и в последующие года эпигенетику ожидают радужные перспективы.

Молекулярная патология

Программные положения

«Традиционная патология занимается морфологическими проявлениями болезней. В дополнение к этому, молекулярная патология включает в себя приборы молекулярной биологии для того, чтобы изолировать и идентифицировать возбудители инфекционных заболеваний, понять роль дифференциальной экспрессии генов в этиологии болезни, предоставить более точные средства для диагностики заболеваний и обеспечить более индивидуализированный подход к терапии.

Многие болезни вызываются наследственными генными мутациями, например, муковисцидоз, мышечная дистрофия и лизосомные болезни накопления (в группу лизосомных болезней накопления (ЛБН) входят 50 — 70 различных редких генетических заболеваний). Другие изменения генов определяют бóльшую предрасположенность организма к заболеваниям, например, раку или болезням сердца.

Ключевыми методами молекулярной патологии для идентификации взаимосвязи между изменениями генов и заболеваниями являются выделение и культивирование клеток, иммуногистохимия, метод FISH и методы лабораторной молекулярной биологии (идентификация генных мутаций, определение профиля экспрессии, анализ белков, блоттинг, микрочипы).

Считается, что развитие злокачественных заболеваний проходит через определенные стадии, такие как гиперплазия, дисплазия, преинвазивный рак, инвазивная карцинома и метастазы, каждая из которых может быть связана с мутациями и изменениями экспрессии подгруппы генов. Лазерная микродиссекция с успехом применяется для выделения отдельных клеток или популяций клеток из ткани (замороженных, зафиксированных срезов тканей и монослоев культур клеток) для последующего генетического анализа, который обеспечивает возможность непосредственного сравнения нуклеиновых кислот клеток на различных стадиях развития болезни.

Влияние изменений генов на функцию белков и на заболевание можно исследовать с помощью различных методов наблюдения. Особенно важными являются такие методы, как наблюдение белок-белковых взаимодействий с помощью метода получения изображений в заданный промежуток времени, микроскопии TIRF и конфокальной флуоресцентной микроскопии, например трехмерный рендеринг и FRET/BRET. Они позволяют проводить пространственный и временной анализ динамических событий, включая, например, рецепторные взаимодействия и другие сигнальные события.»

О вечной репродуктивной жизни и решении экономической проблемы глазами ведущих генетиков

В качестве эпиграфа

— Хорошо, послушай аргументы. Слыхал ли ты легенду о Филемоне и Бавкиде? Так вот, это была самая верная супружеская пара среди людей, и боги даровали им счастье умереть в один день, а после смерти превратили их в дуб и липу. Ромеро собрал все данные о Филемоне и Бавкиде и предложил Справочной просчитать их взаимное соответствие. Угадай, сколько получилось? Восемьдесят семь, на шесть сотых меньше, чем у тебя, чудак! Ты должен петь от радости, а не печалиться!

Герберт Уэллс «Люди как боги».

В этом очерки мы поговорим о интересных перспективах которая открывает нам генетика старения и новые репродуктивные технологии. В качестве примера, обратимся к насущной и злободневной темы касающейся целого спектра проблем, связанных с ЭКО (экстракорпоральным оплодотворением) и суррогатным материнством. Проблема получила свое широкое освещение в средствах массовой информации в связи с недавним благополучным разрешением экстракорпоральным бременем четы А.Пугачевы и Максима Галкина. Очевидно, что речь идет о интересном случае физиологического читерства, то есть обмана определенных процессов природы. Поскольку вопрос о легитном воспроизводстве ооцитов (яйцеклеток) у А.Пугачевой снимается в хотя бы в силу почтенного возраста, то на основании скупых фактов выданных в СМИ можно было предварительно выдвинуть две гипотезы.

Гипотеза A. При зачатии (образовании зиготы) была использована яйцеклетка А.Б, заблаговременно сданная на хранение в репродуктивный репозиторий сильных мира сего. Эта гипотеза, хотя и не столь интересная, косвенно подтверждала мою интуиционистскую догадку о популярности подобных учреждений у известного круга лиц. Но, в отличие от своих предшественников Онанисов и Кеннеди из 70-ых годов прошлого века, замораживавших себя в криокамерах в надежде на свое личное бессмертие, современные представители haute societe замораживают свои герминальные клетки, обеспечивая себя репродуктивным бессмертием. С научной зрения, последнее более разумно, т.к можно становится родителями в любом возрасте — хоть в 60, хоть в 100 лет.

Гипотеза B. Это более интересная гипотеза, но она отсылает к сомнительным с этической и технической точки зрения технологиям, основанных на принципе переноса генов реципиента и внедрения их в (геном) клетки донора. То есть геном донорской клетки был заменен на геном А.Б. Но насколько мне известно такие методики неизвестны, по-крайней мере широкой общественности. Да, технология генных векторов существует давно, но направлены они именно на модификацию отдельных генов, что несоизмеримо проще. Хотя как показали последние эксперименты, она вполне применима к приматам, в том числе и человеку. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — игрунка обыкновенная.

С этой темой — темой интервенции в цикл развития и угасания репродуктивных функции — связан более широкий круг вопросов касающихся интервенции в сам процесс старения — универсальный биологический процесс угасания и деградации функций (потери функциональности) и систем человеческого тела.  Совсем недавно портал Постнаука разместил интересную лекцию биоинформатика Жаронкова. В этой лекции г-н Жаронков имплицитно, то есть неявным способом, в скрытом подтексте своей (в целом) замечательной лекции указывает на прямую связь между решением проблемы старения человека (возрастного кризиса) и глобального экономического кризиса.  Наряду с чисто техническими аргументами генетики (увеличение продолжительности жизни у немотод и дрожжей в 10-15 раз), биогеронтологии  и медицины, автор приводит чисто экономические аргументы:

Насколько мы знаем, если людям что-то дать, потом этого уже не отнимешь. Такого концепта как пенсия до 1887 года, до того, как Отто фон Бисмарк принес это нововведение, эту финансовую инновацию в общество, не существовало. Никто даже не мог себе представить, что люди когда-либо выйдут на пенсию. В США эта концепция была принята в 1930-х годах. Но за восемьдесят лет люди настолько к этому привыкли, что начали считать, что государство им что-то должно. Любое изменение в текущей структуре они понимают как государственную измену и начинают против этого выходить на улицы, бастовать. Хотя государство этого хочет не просто так — государству это нужно для того, чтобы сбалансировать экономику.

Интересно так же отметить упоминание инновационной технологии интервенции в геном — РНК-интерференция. Это «технология, которая позволяет использовать очень небольшие кусочки ДНК или РНК. В зависимости от того, как их доставлять и упаковывать, что будет с ними дальше происходить, мы сможете снижать экспрессию каких-то определенных генов.»

Аналогичные мысли были озвучены и другим исследователем — биофизиком Петром Федичевым в краткой аннотации лекции про старение дрожжей и безопасности лечения старости