Вторая фаза нового проекта

Две недели назад я сообщил об окончании первой фазы своего нового проекта (на первом этапе работы удалось собрать надежную выборку из более чем 5000 образцов более чем 250 различных этно-популяционных групп людей по всему миру.

Как я уже рапортовал ранее, самой сложной из запланированных на втором этапе задач являлась импутирование (импутация) отсутствующих генотипов.  Читатели моего блога помнят, что две предыдущие экспериментальные попытки импутирования больших выборок     — в 2013  и в 2015  — закончились неудачно (или, если говорить точнее, качество импутированных генотипов не оправдало моих завышенных ожиданий). В предыдущих опытах я задействовал мощную комбинацию программ ShapeIT и IMPUTE и  метод импутирования снипов за счет использования большой референсной панели аутосомных гаплотипов (из 1000 genomes),  гарантирующей более аккуратное определение генотипов.

На этот раз, я решил не повторять ошибок, и обратился к использованию других программ — в частности , к  Minimac3, хорошо зарекомендовавшую себя в работе с геномами 1000G.  К моему счастью, я набрел на недавно появившиеся публичные сервера, работающие с «облачным» сервисом импутирования Cloudgene. геномов.
Серверы импутирования геномов позволяют использовать полную референсную панель гаплотипов для точного определения недостающих генотипов в анализируемых данных. Пользователи подобных серверов могут загружать (предварительно фазированные или несфазированные) данные генотипов на сервер. Процедура импутирования  будет осуществляться на удаленном сервере, и по окончанию этого процесса рассчитанные данные доступны пользователю для скачивания. Наряду с импутированием, подобные сервисы позволяют провести процедуру контроля качества (QC) и фазировки данных в качестве предварительного этапа процесса импутирования генотипов.

Прототипы серверов импутирования уже доступны в институте Сангера и Мичиганского университета. В дополнение к вышеназванным серверам, можно упомянуть прототип сервера поэтапной полномасштабной  фазировки генотипов анализируемых образцов (прототип создан биоинформатиками Оксфордского университета). На мой взгляд, самое простое и доступное решение задачи импутирования на удаленном сервере было разработано сотрудниками   Мичиганского университета. Дополнительное преимущество этому решению дает грамотная документация по использованию сервиса.

Основная рабочая лошадка сервиса — это комбинация двух или трех программ — две програмы для фазирования диплоидных генотипов в гаплоидную фазу  ShapeIT и Hapi-UR , а в качестве основного ПО для самого процесса импутирования (определения) недостающих генотипов — вышеупомянутую программу Minimac3.

Описание эксперимента с импутированием генотипов на удаленном сервере

В самом начале,  я разбил свою выборку на пять когорт (т.к. референсные панели на сервере также разбиты на «этнографические группы»):

  1. европейцы (европейцы + кавказцы) — 1715 образцов -87169 снипа
  2. азиаты (+американские аборигены и аборигены островов Тихого Океана) — 2356 образцов — 87044 снипа
  3. африканцы — 1054 образца — 86754 снипов
  4. палеогеномы древних жителей Евразии, Африки и Америки -340 — 594500 снипов
  5. смешанные группы — преимущественно мозабиты, пуэрто-риканцы и др.
QC-Report
На рисунке показана корреляция между частотами аллелей в изучаемоей выборке (здесь: европейская когорта) и частотами аллелей в референсной панели

К моему вящему неудовльствию,  некоторые образцы в сводной выборке не прошли контроль качества — в первую очередь это касается образцов европейцев из базы данных POPRES, а также выборок статьи  Xing et al. (2010). Скорее всего, их нужно будет импутировать отдельно.

Несмотря на значительную скорость обработки генотипов на удаленном сервере, к настоящему времени эксперимент еще не доведен до конца.  Пока я планирую ограничиться импутированием генотипов в 3 первых когортах (т.к. импутирование палеогеномов с помощью современных референсных панелей гаплотипов вероятнее всего приведет к искажению истинного разнообразия палеогеномов за счет проекции на современные группы населения, хотя авторы статьи Gamba et al. 2014 в сопроводительном материале к своей статье утверждают обратное).

После окончания фазирования и последующей обработки генотипов европейской когорты в программе Plink (были отсеяны все варианты с вероятностью ниже 0.9) ,  я получил выборку из 1715 европейцев с 25 215 169 снипами против изначальных 87169, т.е число снипов в выборке увеличилось в 290 раз!
В азиатской когорте соотношение импутированных генотипов к исходным составило чуть меньшую величину 19 048 308 / 87044 = 219.

Проверка результатов

Разумеется, все полученные результаты нуждались в дополнительной проверке качества генотипирования.
Cначала я объединил импутированную европейскую когорту с когортой палеогеномов (которая не была импутирована) и рассчитал в программе PLINK 1.9 матрицу IBS (т.е. сходства образцов в выборке между собой, эта метрика отдаленно напоминает Global Similarity в клиентских отчетах 23andme), а затем усреднил данные по популяциям и произвел по усредненным значениям иерархическую кластеризацию по признакам сходства (IBS, identity by state). Результат превзошел все мои пессимистические ожидания

 

 

Как становится очевидно из приведенной выше кластерограммы,  в целом взаимное расположение популяций в кластерах соответствует (в общих чертах) взаимному географическому положению. Присутствуют, правда, и некоторые огрехи. Так, например, венгры очутились в одном кластере с русскими из Курска,  норвежцы — с русскими из Смоленска, а усредненные «русские» — с американцами европейского происхождения из штата Юта и французами. Трудно сказать, в чем здесь причина, тем более что матрица была составлена по значениям IBS (идентичности по состоянию), а не IBD (идентичности по происхождению).  Более подробные данные о попарных значениях IBS между популяциями выборки можно посмотреть в этой таблице

Импутированная азиатская когорта (несмотря на расширение географии за счет включения образцов коренного населения Америки и аборигенов бассейна Тихого океана)  тоже  оказалась на удивление надежной. Я пока не буду останавливаться на подробностях изучения этой когорты, вместо этого я размещаю здесь результаты MDS- мультдименсионального шкалирования образцов выборки, образованной в ходе слияния 2 импутированных когорт (европейской и азиатской) с 1 неимпутированной (палеогеномы). Цветовое обозначение точек соответствует определенным кластерам, выявленных в выборке с помощью алгоритма MCLUST (cледуя рекомендациям Диенека Понтикоса). Всего этих кластеров 15 и они обозначены последовательностью чисел от 1 до 15, и каждый из этих кластеров имеет свою четкую географическую привязку:

  • 1 — кластер популяций ближнего Востока и  Анатолии
  • 2 — кластер популяций северного Кавказа
  • 3 — «индоевропейский» кластер древних популяций Синташта, шнуровой культуры, Ямной культуры и т.д.
  •  4 — кластер аборигенных жителей Америки (эскимосов и индейцев)
  • 5 — суперкластер популяций средиземноморского и восточноевропейского региона
  • 6 — сибирский кластер алтайских и самодийских популяций
  • 7 — кластер популяций западной и северной Европы
  • 8 — кластер палеосибирских популяций (таких как чукчи, ительмены и коряки)
  • 9 — кластер аборигенных (австронезийских и тай-кадайских) популяций юго-восточной Азии (даи, атаяла и ами)
  • 10 — кластер неолитических популяций
  • 11 — еще один ближневосточно-средиземноморский кластер (ашкеназим, сардинцы и так далее)
  • 12 — кластер североиндийских популяций
  • 13 — кластер центральноазиатских популяций
  • 14 — поволжские популяции
  • 15 — разные групп индусов

 

Реклама

Генетический компонент северных евразийцев (ANE) в свете новых данных

Начало февраля порадовало важным событием: на  сервере Bioraxiv размещен препринт монументальной статьи Haak et al. (Iosif Lazaridis , Nick Patterson , Nadin Rohland , Swapan Mallick , Bastien Llamas , Guido Brandt , Susanne Nordenfelt , Eadaoin Harney , Kristin Stewardson , Qiaomei Fu , Alissa Mittnik , Eszter Bánffy , Christos Economou , Michael Francken , Susanne Friederich , Rafael Garrido Pena , Fredrik Hallgren , Valery Khartanovich , Aleksandr Khokhlov , Michael Kunst , Pavel Kuznetsov , Harald Meller , Oleg Mochalov , Vayacheslav Moiseyev , Nicole Nicklisch , Sandra L. Pichler , Roberto Risch , Manuel A. Rojo Guerra , Christina Roth , Anna Szécsényi-Nagy , Joachim Wahl , Matthias Meyer , Johannes Krause , Dorcas Brown , David Anthony , Alan Cooper , Kurt Werner Alt , David Reich) «Massive migration from the steppe is a source for Indo-European languages in Europe».  Несмотря на то, что сама статья еще находится на стадии препринта, уже сейчас очевидна глубина проработки материала. Нет никаких сомнений в том, что это объемное, вдумчивое и тщательное исследование  войдет в число главных работ в области индоевропеистики. По своей сути, коллектив авторов подвел в этой работе итоги всех предыдущих исследований введенных  «полных геномов» древних жителей Европы (возрастом в 8 000 -4 000 лет),  введенных в научных оборот за последние 2-3 года. Благодаря систематическому подходу к материалу и синтезу предыдущих наработок,  а также за счет использования  новейших физико-химических методов экстрагирования палео-ДНК вкупе с передовым современейшим биоинформатическим программным обеспечением,  авторы смогли строго и скурпулезно подойти к одному из важнейших вопросов истории, лингвистики и археологии — к вопросу о происхождении индоевропейцев.  К чести авторов, они признают, что даже после столь внушительного по своим размерам и качеству исследования, вопрос о первичном месте происхождения индоевропейцев остается открытым, и поэтому собственно обсуждение релевантности исследования палео-ДНК в свете существующих 4 главных теорий  происхождения индоевропейцев занимает в работе относительно мало места (стр.134-139).  Впрочем, вряд ли кто всерьез ожидал от этого исследования окончательного ответа на все вопросы индоевропеистики.  Тем не менее, подробный анализ аутосомного генома, а также однородительских маркеров (митохондриального генома и  Y-хромосомы) представителей целого ряда культур неолита, медногл и бронзового века восточной и западной Европы, и в особенности представителей Ямной культуры,  дает новую подпитку вечному спору между сторонниками разных версий происхождения индоевропейцев (т.к. многие вслед за Гимбутас связывают ямную культуру с общностью протоиндоевропейцев).

annurev-linguist-030514-124812.f2

Зато остальная часть этой 172-страничной работы настолько богата (насыщена) фактическим материалом, что любой, даже самый искушенный, читатель попгенетической литературы получит большое удовольствие от приобщения к плодам многолетней работы умнейших ученых.   А работа, действительно, проделана огромная. Ученые воссоздали геномные данные 69 европейцев, живших между 8 000-3000 лет тому назад, за счет обогащения амплифицированных библиотек палео-ДНК. Эти библиотеки палео-ДНК они использовали для целевого отбора  394577 таргентных полиморфизмов (снипов) в панелях Affymetrix Human Origins. Обогащение именно этих специально отобранных таргентных позиций позволило снизить необходимые для анализа древней ДНК объемы секвенирования в среднем примерно в 250 (!) раз, что позволило авторам изучить на порядок больше лиц в сравнении с предыдущими исследованиями, и получить более полные знания о прошлом.

map

В работе показано, что уже 8,000-5,000 лет  назад население западной и восточной Европы следовали противоположным траекториям развития.

На заре евпропейского неолита, примерно 8,000-7,000 лет назад, отдельныетесно связанные родством и отличные от коренных европейских охотников-собирателей, группы  ранних земледельцев появились в Германии, Венгрии и Испании, в то время как Россия была населена особой группой восточных охотников-собирателей, имеющих родство с населением сибирского палеолита (24 000 л.н.в) , эта группа древних северо-евразийцев (ANE), представлена образцом MA1 (мальчик с палеолитической стоянки Malta-1 из южной Сибири); кроме того, этот компонент неплохо аппроксимируется «сибирской частью» генома изолированных индейцев Южной Америки (каритиана). Два образца охотников-собирателей из России (Карелия и Самары) образуют кластер «восточно-европейских охотников-собирателей «(EHG); пост-мезолитические охотники-собиратели  из Люксембурга, Испании и Венгрии (WHG) находятся на противоположенном конце клина охотников-собирателей, в то время как охотники-собиратели  Швеции  (SHG) находятся посередине. Интересно отметить, что геном охотника-собирателя из Карелии представляет собой смесь 38-40% компонента ANE и 60-62% компонента WHG, причем величина ANE значительно выше 20% ANE, выведенных для  шведского-охотника собирателя Motala-12 в предыдущем исследовании Lazaridis et al 2014).
В соответствии с тем, что EHG являются обмен население больше аллелей с «древних Северной евразийцев» (ГУ 7), чем любой другой.

pca

Примерно  6-5 тысяч лет назад,  на большой части  Европы назад  произошел новый «подъем» потомков мезолитических охотников-собирателей, но в России  степные скотоводы Ямной культуры время произошли от смешивания  предыдущих племен восточно-европейских охотников-собирателей с населением ближневосточного происхождения.  Население Ямной культуры отличалось от своих предшественников -восточно-европейских охотников-собирателей EHG —  меньшим количеством обших аллелей с MA1 (| Z | = 6,7), что  свидетельствует о процессе дисперсии носителей ANE  на территории европейских степей где-то между 5 000-3 000 гг. до н.э. Уменьшение числа общих с образцом MA1 аллелей, вероятно объясняется появлением «примеси» от популяции или популяций, тесно связанных с
популяциями современного ближнего Востока, т.к. самая отрицательная f3-статистика  (отрицательная статистика однозначно свидетельствует о примеси) наблюдается при моделировании жителей Ямной культуры как продукта смешивания носителей компонента EHG  и современных популяций ближнего Востока, таких как армян (Z = -6,3).

Непосредственный контакт между населением западной и восточной Европой состоялся   ~ 4500 лет назад, а в геноме поздне-неолитического населения культуры шнуровой керамики на территории Германии прослеживается 75%-ный «генетический» вклад «степного» компонента представителей ямной культуры. Таким образом геном жителей культуры шнуровой керамики «документирует» массовую миграцию населения с восточной периферии Европы в ее центральные области. Данный «степной» компонент Yamna (гибрид EHG и ближневосточных популяций) сохранялась в значительных пропорциях у всех имеюшисхя образцах из центральной Европы как минимум до ~ 3000 г.н.э, и повсеместно встречается у современных европейцев.

 

admix2

 

Если географическая дихотомия неолитического и мезолитического генетических компонентов в Европе была отмечена еще в работах пионеров популяционной генетки вроде Л. Кавалли-Сфорца, то данные этой работы позволяют вставить последнее звено в решении головоломки. На основании данных можно предположить, каким именно образом третий генетический компонент европейцев (ANE) попал из Сибири  в Европу: сначала этот компонент несли представители EHG,  затем он перешло к «ямникам» (смешанная популяция восточно-европейских охотников-собирателей и населения ближневосточного типа), а затем от ямников к представителям культуры шнуровой керамики, которые представляли собой смесь представителей ямной культуры с средне-неолитическими европейцами.  В настоящее время этот компонент имеет плавное распределение на территории Европы, и по этой причине, мы можем использовать его в анализах структуры как генофонда целых народов, так и генома отдельно взятых людей.

В январе я провел небольшой  эксперимент c «чистым вариантом» аутосомного компонента ANE (ancestral North-Euarasians), впервые описаном в известной работе Lazaridis et al. 2014. Процедура вывода третьего генетического компонента в генофонде европейцев (ANE) оказалась гораздо сложнее, чем я предполагал в начале. Основная сложность заключалась в том, что в отличии от мезолитических и неолитческих сэмплов, у нас нет хорошого образца палеоДНК носителей компонента ANE. Пришлось заниматься реконструкцией генома, используя в качестве заменителей геном MA1 и не-восточноазиатскую часть генома индейцев каритиана. Технически, данный «компонент» был «синтезирован» в программе Plink с помощью 2последовательных запусков генерации «синтетических» популяций на основании частот аллелей аутосомных снипов, вычисленных в3 последовательных запусках программы Admixture.

Я получил компонент с максимально приближенным значениями к значениям компонента ANE в разных популяциях мира в работе Lazaridis et al. 2014. Изучение этого компонента важно для понимания многих неясных моментов истоии древних популяций в восточной Европе и на северном Кавказе. Последние статьи и анонсы лаборатории Давида Рейха к новой статье о составляющих аутосомного генофонда представителей ямной культуры и культуры шнуровой керамики дают основания полагать, что компонент ANE в Евразии могли разносить потоки миграции индоевропейцев, а генетическое разнообразие жителей Европы и Кавказа практически вписывается внутри класссического треугольника (клинов) генетических компонентов ANE-WHG-EEF (см.  ниже график PCA).

10896832_10205857624789575_5582535068712806983_n

Формально,эта гипотеза проверяется с помощью инструментов f3-статистики (A; B,C) — формального теста на статистическую значимость предполагаемого варианта присутствия адмикса двух популяций-доноров в популяции-рецепиенте.

Я решил проверить надежность модели путем представления ряда европейских и кавказских популяций в виде продукта гибридизации носителей компонента ANE с «неолитическим» и «пост-мезолитическим» населением Европы (результаты ниже,  Z в последней колонке.

 

North-Caucas Caucasian ANE -0.0006748 5.13E-05 -13.166
Mesolithic-North Loschbour ANE -0.0011573 0.0001605 -7.21171
Mediterranean-Neolithic Otzi ANE -0.0012012 0.0002376 -5.05634
Mesolithic-North LaBrana ANE -0.0010358 0.0002097 -4.94043
Italian-East Otzi ANE -0.0012473 0.0005013 -2.48825
Italian-East Italian-West ANE -0.0005022 0.0004325 -1.16129
Maltese Otzi ANE -0.0001611 0.0004147 -0.388512
Assyrian-1 Caucasian ANE -0.0002994 0.0009656 -0.310081
Spanish-Canar Loschbour ANE -0.0002557 0.0011264 -0.227017
Italian-East Maltese ANE 2.36E-05 0.0003026 0.0779574
Italian-East Caucasian ANE 6.32E-05 0.000274 0.230808
Spanish-Canar Otzi ANE 0.0003307 0.0012476 0.265081
Assyrian-1 Italian-West ANE 0.0003321 0.0012207 0.272035

Практически все полученные варианты для современных популяций в тесте f3 дали отрицательную Z-оценку.

Буквой Z обозначается стандартная оценка, основанная на нормальном распределении. Иначе говоря, Z-o. является мерой отклонения от среднего, выраженной в единицах стандартного отклонения. Z –оценка будет иметь отрицательную величину, если показатели адмикса будут выше медианного значения.
Очень высокие или очень низкие (отрицательные) Z-оценки, связанные с очень маленькими p-значениями, располагаются в хвостах нормального распределения, и является значимыми, а не случайными. А значит, компонент ANE был индуцирован мною правильно.

 

 

Что еще любопытно, так это то, что третья составляющая современных европейцев — компонент ANE в моем эксперименте плавно разделился на две подсоставляющих — MA1 (древние сибиряки эпохи палеолита) и Кавказ (в качестве основы я брал геномы грузин и армян).

То есть, скорее всего компонент ANE появился в результате смешивания «труъ» древних северных евразийцев и кавказцев. Собственно, об этом намекал Рейх в анонсе своей публикации результатов анализа геномов жителей ямной культуры.

Вероятно, что кавказские популяции (особенно в Дагестане), характеризующиеся высоким уровнем гомо- и аутозиготности в определенном смысле «законсервировали» в своем геноме тот первый массовый вброс компонента ANE в свой генофонд. И по этой причине, например, без специальной методики, в программе Admixture практически весь компонент ANE маскируется бимодальным компонентом, вроде знаменитого Caucas-Gedrosia в одном из первых этно-популяционных калькуляторов проекта Dodecad. Похоже, что генетика может в очередной раз частично примирить две антиномные теории (вернее, целые кластеры теорий) происхождения ИЕ — анатолийскую и степную. Нечто подобное наблюдалось после прочтения геномов неандертальцев и получения убедительных фактов гибридизации предков соврменного человека и архаических гомининов — неандертальцев, денисовцев. В результате чего теории мультирегионального и монорегионального происхождения человка были хотя бы в отдельных моментах приведены к общему знаменателю.

Как я уже упоминал ранее, мой опыт с «выведением» предкового аутосомного компонента индоевропейцев полностью удался. Поскольку всем очевидно, что этот компонент родственен «североиндийскому предковому компоненту» (ANI — обозначение из статьи Reich et al. 2009 и Moorjani et al 2011) о структуре генофонда индийских этнических групп), я взял 10 индийских этнических групп, имеющихся в кураторском наборе лаборатории Райха и проанализировал эту выборку в Admixture на пропорции вхождения их геномов в 2 априорно заданные кластеры. Первый кластер ANE был априорно задан 40 синтетическим индивидами, сгенерированными в программе Plink на основании расчитанных ранее частот аллелей «чистого» компонента ANE. В качестве дополнительного контрольного образца я использовал геном Malta1, т.к. он содержит в себе наивысшее содержание компонента ANE. Второй кластер был задан 4 индивидами Onge (одна из аборигенных народностей Андаманских островов). Как неоднократно указывалось в литературе, именно жители Андаманских островов являются самыми «чистыми» носителями т.н «южно-индийского» предкового компонента ASI (на континенте чистых носителей этого «компонента» не осталось, в том числе и среди популяций дравидов, ведда и мунда). После нескольких экспериментов по эвристическому методу проб и ошибок, я получил более или менее приемлимое разделение индивидов на 2 кластера, а затем вычислил частоты аллелей в каждом из этих кластеров. Любопытно, что в ходе опыта, удалось не только выделить компонент ANI, но и добиться неплохого уровня дискримнации между компонентом ANI, ANE, и благодаря этому, оба компонента могут быть включены в мой следующий этно-популяционный калькулятор.

Надежность компонентов я проверил на собственных данных. В рабочей модели калькулятора K14 удельное распределение этно-генографических компонентов моего генома выглядит следующим образом:

68.75% — европейский мезолитический компонент
13.12% — северо-евразийский компонент ANE
10.23% — европейский неолитический компонент
4% — ANI (северо-индийский предковый компонент)
1.6% — кавказский компонент
1.2% — алтайский компонент
0.2% — сибирский компонент

R Graphics Output