Подведение итогов экспериментов по неформальному моделированию адмикса в популяциях

Выполняю с небольшим опозданием данное ранее обещание и расскажу о слабых местах выявления процентов этнического происхождения с помощью анализа результатов ДНК-тестирования. Последние лет пять этот тип изучения этно-популяционного происхождения с привлечением данных генетики вошел в моду — в 2011 году, когда я первый раз провел подобный анализ существовало все 2 крупные компании в пакет клиентских услуг которых входило проведение подобных анализов клиентских данных. Ровно столько же было заметных в инете любителей, предлагающих более развернутый и разжеванный вариант подобного разбора этнопроисхождения добровольных участников своих проектов. Главным инструментым и тех и других являлись программы типа Admixture и STRUCTURE (разработанные академическими биоинформатиками для решения одной из задач популяционный генетики — а именно определения этнической субструктуры в структуре изучемых в ходе конкретного исследования национальной или региональной выборки народонаселения).
Прошло лет 6, я провел более тысячи подобных экспериментальных анализов — на принципиально разных выборках и образцах аутосомных снипов представителей разных народов. Каждый из таких экспериментов хотя бы немного отличался от других — и не только числом заранее заданных предковых компонентов этнических популяций, но и разнообразием самих этих популяций, их числом и качеством генетипированных в этих популяциях снипов, — например степенью сцепления снипов между собой, процентом минорных вариантов, количеством снипов, соотношение гомо- и гетерозиготных аллельных вариантов. На первом этапе основной проблемой являлась недостаточная представленность отдельных этносов в выборке вкупе с неполным совпадением популяций по числу генотипированных снипов
Позднее я частично научился обходить проблему за счет импутирования аллельных вариантов недостающих (негенотипированных) снипов по большим референсным панелям. В частности используемый Сергеем Козловым калькулятор K27 был сделан мною как раз с использованием таких импутированых вариантов.
Еще позже — после прорыва в области изучения палеоДНК — появилась возможность не угадывать предковые компоненты слепым перибором числка K (предковых компонентов), а задавать заведомо предковые популяции людей (жителей мезолита, неолита и бронзового века) в качестве чистых предковых популяций К современного народонаселения. Таков, например мой этнокалькулятор K11 Ancient, загруженный зимой этого года на Gedmatch.
Всего же за это время я разработал не менее 60 разных моделей в интервале от K=7 до K33, причем для многих K я разработал сразу несколько моделей.

Все эти модели (только калькуляторы; без инструментов поиска ближайших к тестируемому популяций) я размещаю в открытый доступ на OneDrive (ссылка открывается при нажатии на картинку). Эти файлы работают с программой DIYDodecad, инструкцию использования которой можно найти на сайте Диеникиса

























































Я решил подвести итог этому направлению своей деятельности, на которое ушло много сил, cредств и почти все мое свободное время. Вместо этого я переключусь на более точные формальные методы определения этнического происхождения, разработанный в генетической лаборатории Дэвида Райха из Гарварда.

Главная причина — в силу своего перфекционизма я не был доволен точностью определения частот конкретных предковых компонентов в состав генома отдельно взятых людей. Кроме того, этой зимой в ходе бесед с подобным же любителем насчет проблем Admixture, мы обнаружили ряд причин, приводящих при анализе данных отдельно взятых людей к странным и заведомо неверным комбинациям этнического раскалада предков.
Есть еще одна причина — перенасыщение данного маленького сегмента на рынке инетрпретации генетических данных. В настоящий момент существует уже целый ряд компаний (не менее дюжины), вышедших на рынок ДНК-генеалогии в относительно недавнее время. Каждая из них разработала свой алгоритм и красивый графический интерфейс для визуализации данных по прогнозируемому этнопроисхождению клиента. Увеличилось число крепких и активных любителей (я знаю не менее 10 таких людей), занимающихся в принципе тем же самым, причем иногда качества полученных ими моделей этнического происхождения выше таковых в коммерческих компаниях. Благодаря их усилиям, число доступных этнопопуляционных калькуляторов увеличилось буквально в разы.

Но перейдем к конкретике. Часто люди систематически получают странные результаты — таких примеров можно приводить много. Причем иногда такие странные и неверные расклады можно встретить в больших этнических сообществах — например у чеченцев стабильно в MyHeritage выскакивают в раскаладе предковых групп одинаковые 10-15% жителей Британских остров.
Этот, конечно, нелепый пример, отлично иллюстрирует первую проблемы, связанную с разделением выборки и клиентской базы на кластеры. В отличии от любителей; большинство коммерческих компаний (за исключенеим разве что FTDNA, где алгоритм опеределения процентов этнического происхождения разработал как раз любитель) не занимаются поисками настоящих предковых компонентов — вроде европейских охотников-собирателей, земледельцев и скотоводов бронзового века. Вместо этого все образцы популяций — преимущественно из академических источников — объединяются по географическому признаку в отдельные кластеры — например скандинавский или балканские кластеры. Кластеры задаются как условные предковые компоненты (их может быть довольно много — как например в компании AncestryDNA), якобы позволяющие в данном случае более точно выявить недавнее этнопопуляционное происхождение клиента. И что хуже всего в эти же кластеры включают данные самих клиентов — очень часто просто со слов клиента о своем этническом происхождении (как было в своем время в 23andme), хотя в последнее время в некоторых компаниях (AncestryDNAO) алгоритм усовершенствовали путем включения дополнительных фильтров для отсеивания (например с помощью определения в анализе главных компонентов резко отличающихся и резко выделяющихся в плане этнического происхождения клиентов). Тем не менее, даже самое методичное применение всевозможных дополнительных фильтров не может гарантировать повышение точности предика этнического происхождения. Проблема что в человеческих популяциях — за исключением небольшого количества изолированных задрейфованных популяций вроде нганасан, чукчей, ульчей, калашей, папуасов — ни в одной из этнических групп компоненты не являются дискретными, а представляют собой градиенты частот аллелей, очень часто с большим расбросом из-за чего хвосты частот распределния этих частот перекрываются. На практике этот феномен приводит к появлению в индивидуальных клиентских данных фантомных компонентов — например у европейцев часто появляются всевозможные невозможные компонентоы происхождения — Amerindian, Papuan, Onge и так далее. Подобный подход только вносит сумятицу или — говоря статистическим языком — шум в результаты.

Очевидно, что данная проблема связана с классической проблемой статистики — проблемой организации и подразделения выборки. Схожей по характеру проблемой являеется проблема разнообразия выборки используемой для определения компонентов происхождения. Очевидно, что очень сложно впихнуть все генетическое разнообразие человечества в относительно небольшую выборку — даже еслии ее размер достигает полмиллиона или больше образцов (как у 23andme). Проблема в сверхпредставленности отдельных этнических или квазиэтнических групп в подобных базах данных (западных европейцев, американцев, финнов, ашкеназов и так далее). При неравномерности выборки наблюдается другой классический статистический эффект — искажение результатов выборки в сторону наиболее представленных групп (как было в свое время в 23andme, когда наблюдался эффект сверхпредставленности евреев-ашкеназов в количестве так называех генетических совпаденцев).
Еще одна схожая проблема — в количестве совпадающих снипов (одинакового числа снипов) между тестируемыми индивидуальными образцами и референсными группами. Это проблема затрагивает, правда, только калькуляторы разработанные любителями на базе DIYDodecad — в алгоритмах коммерческих компаний число снипов в рефренсных популяциях и индивидуальных образцах одинаково, т.к. анализируются только те образцы, которые тестировались самой компанией. В вышеупомянутых же этнопопуляционных калькуляторах анализируемые всегда «кроссплатформены» — и если разработчик использовал для разработки калькулятора только те снипы, которые содержаться в чипах 23andme, тогда при анализе данных полученных в компаниях FTDNA или AncestryDNA совпадением снипов будет частичным (так как снипы генотипируемые в этих компаниях совпадают лишь частично). В итоге ситуация в которой сравниваются аллельные частоты снипов референсных популяций (полученные при одном количестве снипов) с аллельными частотами снипов индивида (полученные при совсем другом количестве снипов). Элементарная логика подсказывает что в таком случае будет наблюдаться искажение результатов в совершенно непредсказуемую сторону.
К счастью, у обеих проблем есть разумные решения. Число совпадающих снипов между чипами FTDNA, 23andme (разных версий) и AncestryDNA составляет примерно 300 000, что достатчно для создания калькуляторов приемлемых для анализа данных от всех этих компаний. Решение первой же проблемы тоже есть, но его стоимость немыслимо выскоа — необходимл использовать примерно несколько десятков миллионов ПОЛНЫХ геномов популяций людей со всего мира. Разумеется, никакие любители никогда в жизни не смогут собрать такое количество данных необходимых для создания сверхточных калькуляторов.

Все вышеперечисленные проблемы — сущая мелочь в сравнении с настоящими проблемами, обусловленными алгоритмической стороной вопроса. Дело в том, что все компании (и разумееися любители) — так или иначе — при вычислении аллельных частот в компонентах референсных популяций используют программы использующие парадигму Admixture/Structure. А они используют ML-алгоритмы, минимизирующие ГРУППОВЫЕ частоты аллелей между всеми образцами выборки, т.е. аллельные частоты ПОЛНОСТЬЮ зависят от состава исходной выборки, даже в случае так называемого supervised («обучаемого») анализа, в ходе которого некоторые популяции принимаются за исходные «чистые предковые группы». Поскольку в ранних версиях Admixture, отсутствовала опция фиксирования одной из вычисляемых матрицы (P- матрица аллельных частот снипов в каждом из гипотетических компонентов происхождения; Q-матрица — матрица индивидуальных коэффициентов вклада предковых компонентов в индивидуальный геном с общей построковой суммой в 100%), и практически все компании использовали один и тот же алгоритм (он в во всех подобных программх схож — хотя разняться его имплементации и способы оптимизации функции правдоподобия), то все они подвергнуты искажению истинных частот аллелей. Этот косяк вносит решающий вклад в появление фантомных компонентов происхождения.

То, что вычисленные таким способом значения (скажем русского) могут очень сильно отличаться в сравнении с индивидуальными частотами аллелей (для примера такого же русского из той же скажем Орловской области) — было впервые замечено геномным блоггером Polako.
К сожалению, в силу своем личной ненависти к первоначальному разработчику DIYDodecad — греку Диенекису Понтикосу — он не смог дать формальное объяснение феномена и назвал этот феномен «эффектом калькулятора» (как бы намекая на косорукость кода этой утилиты). На самом деле сам калькулятор здесь не причем — все дела в приниципиальных различиях между определение происхождения на основании частот аллелей вычисленных по группе образцов и тем же самым вычислением аллелей, но уже не в группе, а в индивидуальныом порядке. В этом легко убедиться самому — возьмите клиентские данные, например, норвежца. Вставьте его в большую выборку образцов (например 2000 человек) и прогоните в программе ADMIXTURE задав такое количество гипотетических предковых популяций (K), при котором становится заметна субструктура генофонда популяций на внутриконтинентальном уровне. А затем возьмите того же самого норвежца, но уже в единственном числе, и зафиксировав полученные в предыдущем шаге аллельные частоты в виде предковых популяций. Вы увидите, что различия между результатами анализа одних и тех же данных могут достигать 20 а то и более процентов. Это-то и есть ядро так называемого пресловутого эффекта калькулятора. Очевидно, что и Оракул (т.е. инструмент определения ближайших к клиенту этнических популяций а также моделирования происхождения клиента через набор из 2, 3, 4 популяций) в этом случае (искаженных аллельных частот) будет искусственно создавать фантомные предковые популяций. Например, у русского из Владимирской области могут появиться в качестве шведы,
эстонцы или англичане из Кента.

Строго говоря, первым написал об этой проблема некий Vikas Bansal — автор программы iAdmix:

«For comparison, we also ran ADMIXTURE (in supervised mode using the HapMap reference panel of individuals) on the same dataset (see Figure 1(b)). The European and African admixture estimates for each individual were highly consistent between the two methods. For some individuals, the European component of ancestry using our method was split between the TSI and CEU populations. This could reflect one important difference between the two methods in how they use data from reference individuals. Our method finds a maximum likelihood estimate of the admixture coefficients for each individual using the fixed set of allele frequencies. In contrast, ADMIXTURE, in the supervised mode, utilizes data for all individuals (both the reference populations and the individual(s) being analyzed) to estimate the allele frequencies for each cluster or population and maximize the likelihood function summed across all individuals. Therefore, the allele frequencies are determined not only by the genotypes of the reference individuals but also by the individual(s) that are analyzed for admixture. To confirm this, we estimated allele frequencies by running ADMIXTURE twice: (1) using 800 reference individuals simulated using allele frequencies for 8 HapMap populations (100 individuals per population, see previous section) and (2) 800 reference individuals and 1 additional individual with 100% CEU ancestry simulated using the HapMap allele frequencies. Subsequently, we used our method to estimate admixture coefficients for the simulated CEU individual using the two sets of allele frequencies separately. We found that using the first set of allele frequencies, the admixture coefficients for both CEU and TSI were non-zero. In contrast, using the second set of allele frequencies, only the CEU admixture coefficient was non-zero. This was similar to the results observed in the analysis of the Mozabite data and provided an empirical validation of our hypothesis regarding the difference in the admixture coefficients estimated by the two methods.»

Формальный анализ смешивания предковых популяций: белорусы, часть 2

Итак, после определения значимых для формального статистического моделирования комбинаций предковых популяций (или вернее, их суррогатов) представляется возможным смоделировать две вещи. Во-первых, необходимое с точки зрения статистики, число «импульсов» или «потоков» смешивания, а во-вторых, пропорции вклада «предковых» групп в генофонд белорусов.

Результаты анализа в программах qp3Pop и qpDstat показали, что в референтной группы белорусов присутствуют сигналы смешивания трех групп — мезолитических охотников-собирателей Европы (WHG), неолитических популяций земледельцев с Ближнего Востока и cибирских охотников-собирателей (чьи потомки в составе индоевропейцев) распространили свои гены по всей Европе.

Но меня больше интересует вопрос оценки величины доли вклада так называемого «базального компонента»(Basal Eurasian):

«четвертый элемент» — тот «базальный» компонент генофонда Европы, который проявился при моделировании истории сложения генофонда Европы в работе [Lazaridis et al., 2014] (см. раздел 8.4, рис 8.20) — предковой евразийской группой, которая внесла свой большой вклад и в геном неолитических земледельцев. Из аналогичной по методам модели, созданной в рассматриваемой работе [Seguin-Orlando et al., 2014], следует (рис. 8.6), что в геном человека из Костенок эти таинственные «базальные евразийцы» внесли не менее важный вклад, чем и верхнепалеолитические западные евразийцы. Также из модели следует, что он имел и общих, хотя и более отдаленных предков с древними северными евразийцами восточного ствола.

В этих целях я решил использовать в качестве суррогата базального евразийского генома геном Mota (древнего жителя Африки), примерно половину генома которого составлял тот самый пресловутый базальный компонент (результат обратных миграций натуфийского населния Ближнего Востока в восточную Африки)

Итак, в начале используем программу qpWave из того же пакета Admixtools

parameter file: qpWave.par

THE INPUT PARAMETERS

##PARAMETER NAME: VALUE
indivname: data.ind
snpname: data.snp
genotypename: data.geno
popleft: left
popright: right
maxrank: 6

qp4wave2 version: 200

left pops:
Levant_N
Mota
WHG
EHG

right pops:
Han
Onge
Papuan
Kostenki14
Ust_Ishim
Siberian_Upper_Paleolithic

0 Levant_N 13
1 Mota 1
2 WHG 2
3 EHG 3
4 Han 33
5 Onge 15
6 Papuan 14
7 Kostenki14 1
8 Ust_Ishim 1
9 Siberian_Upper_Paleolithic 1
jackknife block size: 0.050
snps: 572603 indivs: 84
number of blocks for block jackknife: 719
dof (jackknife): 631.955
numsnps used: 177238
f4info:
f4rank: 0 dof: 15 chisq: 574.447 tail: 9.47752373e-113 dofdiff: 0 chisqdiff: 0.000 taildiff: 1

<cf4info:
f4rank: 1 dof: 8 chisq: 115.553 tail: 2.7408605e-21 dofdiff: 7 chisqdiff: 458.894 taildiff: 5.4614954e-95
B:
scale 1.000
Onge -0.475
Papuan -0.521
Kostenki14 0.069
Ust_Ishim -0.746
Siberian_Upper_Paleolithic 1.986
A:
scale 290.851
Mota -0.932
WHG 0.299
EHG 1.429

f4info:
f4rank: 2 dof: 3 chisq: 8.502 tail: 0.036691843 dofdiff: 5 chisqdiff: 107.050 taildiff: 1.7204978e-21
B:
scale 1.000 1.000
Onge -0.462 -0.050
Papuan -0.522 -0.105
Kostenki14 0.288 2.189
Ust_Ishim -0.733 0.378
Siberian_Upper_Paleolithic 1.973 -0.232
A:
scale 286.604 578.115
Mota -0.951 -1.197
WHG 0.385 0.752
EHG 1.396 -1.001

f4info:
f4rank: 3 dof: 0 chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 8.502 taildiff: 0.036691843
B:
scale 1.000 1.000 1.000
Onge -0.400 -0.203 1.065
Papuan -0.459 -0.258 0.882
Kostenki14 0.299 2.175 0.273
Ust_Ishim -0.645 0.116 1.513
Siberian_Upper_Paleolithic 2.031 -0.382 0.850
A:
scale 282.949 595.536 1395.824
Mota -0.857 -1.172 0.944
WHG 0.466 0.827 1.449
EHG 1.431 -0.971 0.093

## end of run

Нас интересует статистика f4rank 2, и как видно она убедительна: chisq: 8.502 tail: 0.036691843 dofdiff: 5 chisqdiff: 107.050 taildiff: 1.7204978e-21.  То есть, для моделирования референсной популяции достаточно трех «источников» (в f4rank 3, т.е с 4 предковыми популяциями, статистика гораздо хуже: chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 8.502 taildiff: 0.036691843 ).

Следующим этапом будет оценка пропорций «адмикса», образованного смешением трех «источников»:

 

parameter file: qpAdm.par

THE INPUT PARAMETERS

##PARAMETER NAME: VALUE
genotypename: data.geno
snpname: data.snp
indivname: data.ind
popleft: left
popright: right
maxrank: 8

qpAdm version: 200

left pops:
Belarusian
Mota
WHG
EHG
right pops:
Han
Onge
Papuan
Kostenki14
Ust_Ishim
Siberian_Upper_Paleolithic
0 Belarusian 25
1 Mota 1
2 WHG 2
3 EHG 3
4 Han 33
5 Onge 15
6 Papuan 14
7 Kostenki14 1
8 Ust_Ishim 1
9 Siberian_Upper_Paleolithic 1
jackknife block size: 0.050
snps: 572603 indivs: 96
number of blocks for block jackknife: 719
dof (jackknife): 628.796
numsnps used: 227599
codimension 1
f4info:
f4rank: 2 dof: 3 chisq: 20.724 tail: 0.000120097824 dofdiff: 5 chisqdiff: -20.724 taildiff: 1
B:
scale 1.000 1.000
Onge -0.502 0.176
Papuan -0.562 0.218
Kostenki14 0.442 2.074
Ust_Ishim -0.735 0.779
Siberian_Upper_Paleolithic 1.923 -0.110
A:
scale 285.645 552.926
Mota -1.490 -0.238
WHG 0.017 1.685
EHG 0.883 -0.324
full rank 1
f4info:
f4rank: 3 dof: 0 chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 20.724 taildiff: 0.000120097824
B:
scale 1.000 1.000 1.000
Onge -0.502 0.178 0.403
Papuan -0.599 0.280 0.995
Kostenki14 0.455 2.029 -0.773
Ust_Ishim -0.773 0.879 1.373
Siberian_Upper_Paleolithic 1.893 0.008 1.168
A:
scale 288.199 555.700 1346.772
Mota -1.449 -0.056 0.947
WHG 0.026 1.726 0.141
EHG 0.948 -0.132 1.444
best coefficients: 0.318 0.148 0.534
ssres:
0.000295769 0.000789821 0.000059100 0.001247609 0.001271289
0.335431254 0.895733409 0.067025433 1.414909018 1.441765444

Jackknife mean: 0.316895017 0.150748678 0.532356305
std. errors: 0.035 0.067 0.045
error covariance (* 1000000)
1212 -1838 625
-1838 4506 -2668
625 -2668 2043
fixed pat wt dof chisq tail prob
000 0 3 20.724 0.000120098 0.318 0.148 0.534
001 1 4 125.483 0 -0.088 1.088 0.000 infeasible
010 1 4 25.750 3.55457e-05 0.378 0.000 0.622
100 1 4 102.973 2.28952e-21 0.000 0.702 0.298
011 2 5 336.445 0 1.000 0.000 0.000
101 2 5 127.950 6.47788e-26 0.000 1.000 0.000
110 2 5 184.757 0 0.000 -0.000 1.000
best pat: 000 0.000120098 - -
best pat: 010 3.55457e-05 chi(nested): 5.025 p-value for nested model: 0.0249831
best pat: 101 6.47788e-26 chi(nested): 102.201 p-value for nested model: 5.01661e-24

end of run

Итак, лучшими коэффициентам (пропорциями адмикса) являются 0.318 0.148 0.534. То есть референсная популяция белорусов может быть смоделирована как 30 % базального компонента, 15% компонента мезолитических охотников собирателей и 53% компонента жителей степи бронзового века («индоевропейцев»). Очевидно, что большая часть базального компонента попала в Европу вместе неолитическими земледельцами, а оставшаяся часть — была принесена индоевропейцами.

 

Размышления над эффективностью алгоритма SPA

Перед тем,  как закрыть тему SPA, я решил поразмышлять о причинах неточности определения географического ареала происхождения с помощью генома. Те, кто воспользовался моей моделью для программы SPA (последняя версия — сентябрь 2016 года), могли убедится в том, что даже при наличии большого количества маркеров, модель не во всех случаях точно определяет ареал происхождения (даже с поправкой на погрешность радиусом в 500 км).
В основу алгоритма SPA положены примерно те же самые предпосылки, что и в случае с классическим анализом главных компонент (PCA)

  • Первая предпосылка  подхода SPA состоит в том, что частота аллели каждого SNP в популяции может быть смоделирована в виде непрерывной двумерной функции на карте. Другими словами, при выборе хромосомы индивидуума из локации с позицией (х, у) на карте, вероятность наблюдения минорного аллеля в SNP j на хромосоме может быть сформулирована в виде функции F (х, у), где Fj является непрерывной функцией, описывающей поведение частоты аллеля в зависимости от географического положения
  • Затем на основании сказанного делается упрощающее предположение, что эта функция является экземпляром логистической функции

 

где х представляет собой вектор переменных, указывающих географическое местоположение и а и Ь коэффициенты функции. Авторы понимают каждую из этих функций, как функцию FJ функции наклона градиента частота в SNP J. Эта функция кодирует крутизну склона по норме а, при этом предпологается что смещение параметра b фиксировано. Кроме того, направленность наклона  кодируется в значении вектора а.  Более подробно, θj = арктангенс (aj(1) / aj(2)) могут быть приняты в знчения угла для SNP j, где aj(1)  и aj(2)  являются первым и вторым элементами вектора а.

Поскольку SPA имеет явные географические координаты, подход может быть расширен для систем за пределами обычной картезианской двумерной плоскости координат. В качестве демонстрации этого, авторы программы SPA использовали алгоритм для анализа пространственной структуры населения земного шара, в которой двухмерное отображение на двухмерной плоскости не может точно фиксировать структуру популяции. Таким образом, каждый индивид проецируется на точку земного шара в трехмерном пространстве. Соответственно, авторы использовали трехмерный вектор х (с ограничением || х || равным определенной константе), чтобы представить индивидуальную позицию.

Используя данные (генотипы индивидов из различных популяций из  HGDP), авторы обнаружили что пространственная топология расположения индивидов в пространстве SPA мы наблюдали, что сильно напоминала топологию географической карту мира. В частности, люди из того же континента были сгруппированы вместе, а континенты были разделены примерно так, как это следовало бы ожидать из пространственного расположения.

ng-2285-f3

 

Главная проблема метода состояла в другом. Несмотря на точность топологии взаимного расположения индивидов,  на карте SPA сильно искажены расстояния между континентами.

Например, продольный размер континента Евразии составил 92 градусов в  SPA-пространстве земного шара, в то время как в пространстве реального земного шара — 150 градусов. Продольное расстояние между Европой и Северной Америкой составило 167 градусов на SPA карте земного шара, в то время как на самом деле оно составляет 90 градусов.  Любопытно отметить, что мой опыт работы с этой программы показал, что наибольшую проблему составляют географические координаты долготы, в то время как широты предсказываются довольно точно. То есть по какой-то причине (несимметричность генетических градиентов в направлении север-юг и направлении восток-запад?) пространство SPA очень сильно искажается в продольном измерении (т.е в долготу).
По этой причине, вычисленные географические точки происхождения для европейцев часто оказываются в Атлантическом океана и так далее.

Я решил использовать данные импутированных генотипов для европейских популяций (я занимался их импутацией на протяжении последнего полгода). На этот раз я ограничился только европейскими популяциями. Я  сделал два разных набора с разным числом снипов — один с 1 062 376 снипами, которые содержатся в платформах генотиприрования клиентов 23andme и FTDNA, другой — примерно 590 395 снипов.  Обе модели можно скачать с Google Drive  (здесь и здесь).

Несмотря на тщательный подбор снипов, обе модели продолжают страдать характерным сдвигом географических долгот, а это означает, что данная проблема обусловлена не выборкой генотипов, а самим алгоритмом программы (т.е. улучшение качества выборки или увеличение количества снипов не приводит к повышению точности даже в том случае, если мы используем для тренировки программы на обучающей выборке  индивидов с известной географической локацией).

Это хорошо видно на полученных в ходе анализа моих собственных данных географических координатах 2 точек происхождения (одна из них в Гренландии,  другая в Средиземном море)

untitled

Разумеется, вряд ли можно говорить о точности подобных вычислений. В ходе размышлений над способом решения проблемы я вспомнил о существовании ортогонального прокрустового анализа.

Я взял две матрицы — одну с географическими координатами (фактически центроиды — географические центры стран) и  вторую с предсказанными  (в модели 1M cнипов) величинами географических координат тех же самых образцов (с усредненными значениями по этносам), а затем совершил прокрустово преобразование в программе R, получив новую матрицу с преобразованными значениями координат. Ниже виден результат операции (преобразованные усредненные координаты образцов спроецированы вместе с центроидами на карту Европы). И хотя координаты по-прежнему немного сдвинуты относительно истинных, в целом результат уже гораздо лучше (правдоподобнее).rplot14При проведении прокрустова анализа, кроме Xnew (трансформированной матрицы),  мы получили значения матрицы вращения R, s- коэффициент масштабирования и tt — вектор трансляции координат, минимизирующие дистанцию между матрицей предсказанных координат и матрицей географических координат.

Эти значения можно использовать для коррекции значений географических координат, рассчитанных в SPA. Я снова использую свои данные (2 предсказанные точки географического происхождения Xp):


Xt=sRXp + 1tt


При подстановке Xp получаем следующие значения

точка A:  60.245448+-11.059673 северной широты;  21.394898 +- -5.979712  восточной долготы (северо-западная Балтика и Скандинавия)

точка B: 43.000748+-8.801889 северной широты;  20.725216+-52.159598 восточной долготы (юго-восточная Европа, Балканы и Греция).

 

 

 

 

 

Анализ древней ДНК – проблемы, их преодоление и результаты

На портале Генофонд.ру размещен реферат важной статьи, подводящей промежуточные итоги изучения древней ДНК. Я позволю себе удовольствие процитировать себе некоторые места этого замечательного обзора, написанного ув. Надеждой Марковой

Термин «древняя ДНК» возник в научной литературе в 1980-х годах в связи с появлением новой области исследований, которая получила название «молекулярная палеонтология». С развитием сначала методов ДНК-амплификации (полимеразной цепной реакции), а потом методов секвенирования нового поколения эта область получила мощный толчок к развитию и сегодня стала основным средством реконструкции эволюции живых организмов, и в том числе реконструкции истории человека.

Революция в эволюционной генетике

Исследование древней ДНК совершило революцию в эволюционной генетике, так как появилась возможность напрямую исследовать прошлое, законсервированное в «капсуле времени» ДНК, пишут авторы статьи. Работы последних десятилетий показали, что древняя ДНК может сохраняться в костях, зубах, мумифицированных и замороженных тканях, и может быть извлечена из этих древних образцов. Впервые древняя ДНК была извлечена в 1984 г. (Higuchi et al.) из высохшей мышцы вымершего родственника зебры. Но ее анализ целиком зависел от развития технологий, поэтому стал возможен с появлением ДНК-амплификации (метод полимеразно-цепной реакции – ПЦР), и вышел на новый уровень с появлением методов секвенирования нового поколения. На рисунке авторы представили основные вехи в истории изучения древней ДНК.

О методологии исследования палео-ДНК

Методы палеогенетики оказались незаменимы, чтобы разобраться в  ключевых этапах человеческой цивилизации. Например, понять, как именно происходила смена обществ охотников-собирателей на первых земледельцев, как распространялось по Европе сельское хозяйство – имела ли место передача технологий от одних популяций другим или же происходила смена самих популяций («циркуляция идей или людей»). Анализ древней ДНК показал, что между периодами 8 и 5 тысяч лет назад Европа не была генетически однородной: первые земледельцы с Ближнего Востока мигрировали в Западную Европу и  смешивались там с местными охотниками-собирателями. В Восточную Европу около  6-5 тыс. лет назад туда пришли группы людей из Анатолии, которые смешавшись с охотниками-собирателями, дали начало популяциям скотоводов, наиболее успешная из которых известна по ямной культуре.  Полагают, что именно миграции ямников из понто-каспийских степей на запад и на восток около 4,5 тыс. лет назад можно связать с распространением технологий и, возможно, языков индоевропейской семьи.

Древняя ДНК может помочь и в изучении развития признаков, характерных только для Homosapiens, таких как речь, подчеркивают авторы статьи. Изучение генетических вариаций, связанных с языком, дает информацию о том, когда мог возникнуть сложный  язык, присущий человеку. Так, было показано, что определенный вариант гена FOXP2 (именно его в первую очередь связывают с развитием речи)  имелся уже у неандертальцев. Вероятно, считают специалисты, этот вариант возник у общих предков неандертальцев и современного человека.

Древняя ДНК помогает в изучении адаптации человека к разным условиям среды. При анализе древних геномов в них были выявлены сигналы отбора, связанных с изменением диеты, чувствительностью к ультрафиолету  и пр. Так, становится ясно, как распространялись по Европе такие черты, как светлая кожа и толерантность  к лактозе (способность переваривать молоко во взрослом возрасте).

Трудности в изучении палео-ДНК и их преодоление

Одна из основных проблем, с которыми сталкиваются исследователи древней ДНК, это ее деградация, которая неизбежно происходит со временем.  Обычно ДНК из древних образцов сильно фрагментирована, загрязнена микробной ДНК и химически модифицирована. Причем степень деградации  в больше степени зависит от условий, в которых находился древних образец (температура, влажность), чем от его возраста. Последние исследования показали, что теоретический предел возраста образца, из которого можно извлечь ДНК, составляет 1-1,5 млн лет. Авторы описывают методы, которыми можно преодолеть трудности, связанные с особенностями древней ДНК.

Фрагментация ДНК может быть частично преодолена с помощью современных протоколов, позволяющих извлекать и анализировать очень короткие фрагменты, длиной 50-70 нуклеотидов. К тому же, методы секвенирования нового поколения ориентированы на анализ коротких фрагментов, длина которых составляет 50-100 нуклеотидов.

Большую проблему составляет контаминация древней ДНК современной ДНК. Преодолеть ее нужно путем строгого соблюдения протоколов, учитывающих правила сбора образов, обработки рабочих помещений, применение методов ДНК-аутентификации, независимой перепроверки результатов и пр. Развиваются также методы механической и химической деконтаминации – авторы их описывают.

Еще одна важная проблема – посмертное изменение ДНК из-за гидролиза и окисления, вызывающее деаминацию нуклеотидов, которая ведет к ложным результатам ПЦР. Авторы описывают несколько молекулярно-генетических и биоинформатичесих подходов для преодоления этой проблемы, с ними можно ознакомиться в тексте статьи.

Инструменты анализа

С увеличением числа образцов древней ДНК ученые получают возможность исследовать древнюю генетическую изменчивость на популяционном уровне и сравнивать ее с современной. Различные методы (PCA, STRUCTURE, ADMIXTURE, SPAMIX, SPA, ADMIXTOOLS, GPS, LAMP, HAPMIX,  reAdmix, MUTLIMIX, mSpectrum, SABER и др.), которые были разработаны для анализа современных популяций, применяются и к древним популяциям. В комбинации с антропологическими данными и историческими  сведениями они позволяют реконструировать пути миграций, определять состав предков той или иной популяции, выяснять географическое  происхождение гаплотипов.

Эпигенетика и палео-ДНК

Фенотипическое проявление генотипической изменчивости зависит не только от изменчивости тех или иных аллелей в геноме, но и от степени экспрессии генов, а она во многом определяется химическими модификациями, не затрагивающими последовательность нуклеотидов в ДНК, то есть эпигенетическими. Это метилирование ДНК, модификация белков-гистонов, спектр некодирующей РНК. Последние исследования показали, что некоторые эпигенетические модификации сохраняются и postmortem. Так, удалось картировать метилирование генома неандертальцев и денисовцев. Выяснилось, что некоторые гены были более метилированы у древних людей, чем у современных. Анализ метилирования позволяет также определить возраст индивида (как современного – что важно для криминалистики, так и древнего).

Новая программа для анализа субструктуры популяции

На ресурсе Bioarxiv опубликован препринт статьи, описывающей новую программу для анализа предковых компонентов в изучаемых геномах.  Программа называется Ohana (Linuxовские исходники доступны на Github).

Программа представляет собой дальнейшее развитие парадигмы, использованной при создании программ подобного рода, в том числе и популярных Admixture/STRUCTURE.

Что же именно представляет собой программа Ohana:

Мотивация:  методы выявления генетической cтруктуры популяции часто используются в процентной классификации (доли различных компонентов происхождения) отдельных образцов (геномов) в выборке популяции.
Вклад: Мы вводим новый алгоритм оптимизации классической модели структуры в рамках максимального  правдоподобия. Используя анализ реальных данных, мы показываем, что новый алгоритм оптимизации находит более высокие значения оценки правдоподобия, в сравнении с стандартными методами,   за то же самое время вычислений. Мы также представляем новый метод оценки деревьев популяций предковых компонентов с использованием гауссовой аппроксимации. Используя модель коалесценции популяций,  мы моделируем  эволюцию популяций в виде дерева, а затем исследуем адекватность модели структуры и гауссовской аппроксимации в  правильной идентификации предковых  компонентов родословной и вывода правильной типологии дерева популяций. В большинстве случаев предковые компоненты выводятся правильно, хотя очевидно, что  размер выборки и количество времени, прошедшего с момента смешивания предковых компонентов могут влиять на статистическую достоверность выводов. Вместе с этим, популярная гауссовская аппроксимация  работает гораздо хуже в случае с длинными ветвями популяционного дерева, хотя сама топология дерева была определена правильно во всех рассматриваемых сценариях. Новые методы реализованы средствами языка C++  вместе с соответствующими средствами визуализации в программном пакете Ohana.

Судя по описанию, метод явно продвинут в сравнении с Admixture, и поэтому я решил протестировать программу на своих данных. Поскольку задачей опыта являлась только проверка быстродействия и эффективности программы, я ограничился лишь малым числом снипов (около 1000 снипов) и небольшим числом итерационных шагов. Ниже таблица значений параметра максимальной правдоподобности для разных шагов:

step global-lle local-lle lle-ratio
21 -2.6833044517734939e+00 +2.2770091451382113e-01 +5.8220107325746300e+00
1 +5.7815216343991231e+00 +5.8036336413385650e+00 +4.4224013878883639e-02
7 -3.2739383333912819e-01 +2.2497694453045547e-01 +1.1047415557391673e+00
11 +9.0926715174206318e-01 +2.0066743030967706e+00 +2.1948143027094149e+00
3 +2.8748265011322980e+00 +2.9590787934518543e+00 +1.6850458463911266e-01
7 +8.4540873293179075e-01 +1.3498715551047624e+00 +1.0089256443459433e+00
37 -9.0929035297321050e+00 -2.4194504122282945e+00 +1.3346906235007621e+01
23 -6.4421783036780722e+00 -2.9697235103566051e+00 +6.9449095866429342e+00
0 +9.1345873004805362e+00 +9.1345873004805362e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.4695915386474794e+00 +3.4695915386474794e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.3865281380151862e+00 -1.8991488640961749e+00 +4.9747585478380225e+00
4 +1.0433650310897962e+00 +1.2522823332105344e+00 +4.1783460424147645e-01
3 +3.8995915259094627e-01 +5.1634020990696783e-01 +2.5276211463204312e-01
15 -2.6434691070829723e+00 -9.1086633128607586e-01 +3.4652055515937930e+00
23 -6.2198104594655677e+00 -2.8358886349280032e+00 +6.7678436490751288e+00
38 -9.2321798956810461e+00 -2.4916759096277969e+00 +1.3481007972106498e+01
18 -3.0934554567431443e+00 -8.3611477310109894e-01 +4.5146813672840906e+00
8 -2.9282539314651679e-01 +3.5738671950948531e-01 +1.3004242253120042e+00
0 +1.2524391609263201e+00 +1.2524391609263201e+00 +0.0000000000000000e+00
23 -6.3837385390039652e+00 -2.9271554091217755e+00 +6.9131662597643793e+00
2 +4.7424981408020610e+00 +4.7836466971388827e+00 +8.2297112673643369e-02
38 -9.2130245369173807e+00 -2.3278870997257695e+00 +1.3770274874383222e+01
1 +2.1840574314321817e+00 +2.1865405531001443e+00 +4.9662433359252134e-03
41 -1.1365527747446823e+01 -3.8377028622021787e+00 +1.5055649770489289e+01
19 -4.6712611393212642e+00 -2.1928314855773308e+00 +4.9568593074878669e+00
6 +1.3815323261198040e+00 +1.8025611535312844e+00 +8.4205765482296080e-01
23 -4.9303692315665009e+00 -1.5318143061696987e+00 +6.7971098507936043e+00
0 +8.7328319984824621e+00 +8.7328319984824621e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.6224582165934160e+00 -1.4932121483648810e+00 +4.2584921364570700e+00
3 +6.2377234983784291e-01 +7.6110530798112475e-01 +2.7466591628656367e-01
0 +2.8587282041554891e+00 +2.8587282041554891e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.0021218825872920e+00 +1.4509671718689843e-01 +4.2944371995483808e+00
17 -7.4762584701409729e-01 +1.3932955886732108e+00 +4.2818428713746162e+00
23 -6.0653903327212779e+00 -2.6838881450153060e+00 +6.7630043754119438e+00
37 -1.0579776808339723e+01 -3.8892391993640034e+00 +1.3381075217951439e+01
26 -7.2335181019782047e+00 -3.1331829046686970e+00 +8.2006703946190154e+00
7 +1.6176269530996734e+00 +2.1323381483718942e+00 +1.0294223905444415e+00
33 -9.4030285154229958e+00 -3.6623273360729955e+00 +1.1481402358700000e+01
17 -2.6786343483216859e+00 -4.8812953327852648e-01 +4.3810096300863188e+00
23 -6.2058034431150313e+00 -2.8516189784547787e+00 +6.7083689293205051e+00
67 -1.6909072528028993e+01 -2.3911037254752712e+00 +2.9035937605107442e+01
23 -6.3833745927401013e+00 -2.9452455097675125e+00 +6.8762581659451776e+00
6 -6.8296012812943019e-01 -2.9942977621450506e-01 +7.6706070382985025e-01
10 -9.8126315419471322e-01 -2.3661063865609844e-02 +1.9152041806582067e+00
0 +5.7982106350815634e+00 +5.7982106350815634e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -1.3501638874870379e+00 -3.2011308106384817e-01 +2.0601016128463794e+00
43 -1.2192493550573289e+01 -4.1196420795722730e+00 +1.6145702942002032e+01
9 -1.2593028903325809e+00 -4.3270295902646971e-01 +1.6531998626122224e+00
26 -6.2578642716373176e+00 -2.2062845684156107e+00 +8.1031594064434138e+00
18 -4.6071642202381673e+00 -2.2886078113529225e+00 +4.6371128177704897e+00
10 -1.6054495070597854e+00 -6.2383936794881567e-01 +1.9632202782219395e+00
0 +5.9054976846801948e+00 +5.9054976846801948e+00 +0.0000000000000000e+00
28 -7.9544016666424726e+00 -3.4037434923762198e+00 +9.1013163485325066e+00
13 -2.9739447952442584e+00 -1.6013630431924359e+00 +2.7451635041036448e+00
4 +1.9967631453426975e+00 +2.2200585780891835e+00 +4.4659086549297200e-01
39 -1.0623165622856330e+01 -3.6098560664792703e+00 +1.4026619112754119e+01
4 +1.3492145910943503e+00 +1.5207738925609045e+00 +3.4311860293310836e-01
4 -4.8375924280681382e-02 +1.4610896360477543e-01 +3.8896977577091363e-01
7 +8.1849987178406280e-01 +1.2983567287204032e+00 +9.5971371387268078e-01
5 +1.6411578376630134e+00 +1.8879445182589061e+00 +4.9357336119178541e-01
20 -5.3566590509046721e+00 -2.5267308158062618e+00 +5.6598564701968206e+00
20 -3.7357745162316442e+00 -9.4441504240310703e-01 +5.5827189476570744e+00
0 +6.9003012244484054e+00 +6.9003012244484054e+00 +0.0000000000000000e+00
14 +1.0212512913520566e-01 +1.6552863620284790e+00 +3.1063224657865467e+00
14 -3.4484977966479979e+00 -1.8336229600851968e+00 +3.2297496731256023e+00
33 -8.5640317341738701e+00 -2.9981723641670950e+00 +1.1131718740013550e+01
0 +7.6321228134304206e+00 +7.6321228134304206e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.0411387531718366e+00 +3.0411387531718366e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.8803472670016577e+00 +3.8803472670016577e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +4.2070184059954663e-01 +1.6582565595913112e+00 +2.4751094379835292e+00
0 +9.4043783383643351e+00 +9.4043783383643351e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +3.9493772701791690e+00 +4.0401282575008803e+00 +1.8150197464342277e-01
7 -8.2136167712014529e-01 -3.6756700619833005e-01 +9.0758934184363049e-01
3 +1.2561184081287848e+00 +1.3862458241709996e+00 +2.6025483208442957e-01
46 -1.3514965313978369e+01 -4.6676326406095789e+00 +1.7694665346737580e+01
4 +2.3316433138862669e+00 +2.4883134289675559e+00 +3.1334023016257806e-01
15 -3.1749597466612700e+00 -1.4486952266745639e+00 +3.4525290399734123e+00
0 +3.6076601056818594e+00 +3.6076601056818594e+00 +0.0000000000000000e+00
6 -1.3547629288250551e-01 +2.0571844793874394e-01 +6.8238948164249891e-01
0 +3.3538897545168909e+00 +3.3538897545168909e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -6.6085068659091144e+00 -1.9851117443357860e+00 +9.2467902431466573e+00
6 -7.5147980093472455e-01 -3.9214478407419762e-01 +7.1867003372105387e-01
0 +3.9963783521703307e+00 +3.9963783521703307e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.2911893761129702e+00 +3.2911893761129702e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.2846786735668649e+00 -1.1408980141492142e+00 +4.2875613188353014e+00
14 -1.4178238173926916e+00 +1.2253279138372619e-01 +3.0807132175528356e+00
14 -3.3434887984775541e+00 -1.6779029394864886e+00 +3.3311717179821310e+00
0 +9.1572547755033096e+00 +9.1572547755033096e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.2626932054166078e+00 -3.5141586686062176e-01 +1.8225546771119721e+00
19 -1.8461856116383517e+00 +6.1853369726772289e-01 +4.9294386178121492e+00
8 -1.0410086051735501e+00 -3.4965278679539402e-01 +1.3827116367563121e+00
31 -6.5429305189645044e+00 -1.4024683499866222e+00 +1.0280924337955764e+01
1 +1.2012483311196434e+00 +1.2246107704918217e+00 +4.6724878744356602e-02
27 -6.3263423782410699e+00 -2.0387502987785164e+00 +8.5751841589251079e+00
0 +3.4752054267394046e+00 +3.4752054267394046e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.3260016674493693e+00 -1.6641525377097302e+00 +3.3236982594792783e+00
2 +4.6391346051693745e+00 +4.7074159854863442e+00 +1.3656276063393946e-01
18 -1.7655900381188054e+00 +5.6763635576112303e-01 +4.6664527877598569e+00
5 +2.6107959381474792e+00 +2.9007775105489291e+00 +5.7996314480289968e-01
5 +2.1843942491619988e+00 +2.4627753404760413e+00 +5.5676218262808508e-01
0 +3.6852550999196674e+00 +3.6852550999196674e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +2.2205561518413388e+00 +3.0234170340292152e+00 +1.6057217643757529e+00
6 +1.3664382420077841e+00 +1.6966274552596250e+00 +6.6037842650368184e-01
19 -4.4023423595988431e+00 -1.8800350949122522e+00 +5.0446145293731819e+00
0 +3.8688677137151655e+00 +3.8688677137151655e+00 +0.0000000000000000e+00
73 -2.0949919293569959e+01 -4.7907197907594652e+00 +3.2318399005620989e+01
1 +3.5554293807950907e+00 +3.5653571640236477e+00 +1.9855566457113838e-02
61 -1.7504913653374910e+01 -4.7134638568973735e+00 +2.5582899592955073e+01
15 -2.3496916597601460e+00 -6.1989728884619355e-01 +3.4595887418279050e+00
9 -1.1124922469964771e+00 -3.9306629177513219e-01 +1.4388519104426898e+00
40 -1.0130420397429226e+01 -2.7600791428097899e+00 +1.4740682509238873e+01
28 -6.2646417800198462e+00 -1.8712309259120481e+00 +8.7868217082155962e+00
30 -8.2940098011971699e+00 -3.2575093442052663e+00 +1.0073000913983808e+01
16 -3.9789358263553369e+00 -2.0447399120105771e+00 +3.8683918286895196e+00
24 -4.7319936861905374e+00 -1.2309206168595050e+00 +7.0021461386620647e+00
50 -1.4771830397990250e+01 -4.7468160179959664e+00 +2.0050028759988567e+01
66 -1.9775329423936054e+01 -5.7044932592467479e+00 +2.8141672329378611e+01
27 -6.4821921796055166e+00 -2.3071428385722479e+00 +8.3500986820665375e+00
22 -6.0637478907011628e+00 -2.8387301708702379e+00 +6.4500354396618498e+00
19 -3.3145656028033086e+00 -8.2787439053755918e-01 +4.9733824245314988e+00
11 +1.8067628327733143e-01 +1.3070242269646046e+00 +2.2526958873745464e+00
0 +1.0664985244463050e+01 +1.0664985244463050e+01 +0.0000000000000000e+00
11 -7.5458750582718714e-01 +3.4696598960010006e-01 +2.2031069908545744e+00
0 +6.3845634692411757e+00 +6.3845634692411757e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +1.2253166144940426e+00 +1.7013611250364296e+00 +9.5208902108477389e-01
0 +2.2332252301150746e+00 +2.2332252301150746e+00 +0.0000000000000000e+00
31 -8.0519218099965713e+00 -2.9846513008391273e+00 +1.0134541018314888e+01
4 +2.4692778009043783e+00 +2.6471239053685025e+00 +3.5569220892824838e-01
6 +3.5474308704061017e+00 +3.9320576649321666e+00 +7.6925358905212970e-01
1 +7.6321929467552163e-01 +7.7371899642427522e-01 +2.0999403497507174e-02
20 -4.6091354660655464e+00 -1.8831451771238030e+00 +5.4519805778834867e+00
37 -1.0129886889420138e+01 -3.5049438312000651e+00 +1.3249886116440146e+01
9 -1.3478953370113151e+00 -6.1126866473294861e-01 +1.4732533445567331e+00
15 -3.5603325674454434e+00 -1.8336902540647766e+00 +3.4532846267613335e+00
23 -5.8756875138002860e+00 -2.4885147744651173e+00 +6.7743454786703374e+00
25 -5.2630197987481564e+00 -1.4901283126568581e+00 +7.5457829721825966e+00
22 -4.6505867423895806e+00 -1.5418656747224535e+00 +6.2174421353342542e+00
7 -5.9552142856104151e-01 -8.8676524949510060e-02 +1.0136898072230629e+00
61 -1.8469603264559318e+01 -5.5085368441738511e+00 +2.5922132840770935e+01
0 +6.5611806224091760e+00 +6.5611806224091760e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.2454424814746222e+01 -3.8756241090360741e+00 +1.7157601411420295e+01
2 +1.4936790971716833e+00 +1.5443157230138103e+00 +1.0127325168425383e-01
24 -4.9855905349318244e+00 -1.3691134474993452e+00 +7.2329541748649584e+00
0 +5.4059733116587152e+00 +5.4059733116587152e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -8.3287727010210553e+00 -3.5109736380446810e+00 +9.6355981259527486e+00
6 -9.0525257564573103e-01 -4.9035877015595108e-01 +8.2978761097955989e-01
8 -6.4300983752890950e-02 +6.2949995221823674e-01 +1.3876018719422554e+00
18 -1.6807476972921531e+00 +5.8624083453305964e-01 +4.5339770636504255e+00
1 +3.5721205803909095e+00 +3.5818192117155454e+00 +1.9397262649271774e-02
24 -6.1577637742262690e+00 -2.4834183189506129e+00 +7.3486909105513121e+00
27 -7.1496869791234205e+00 -2.9244287522105861e+00 +8.4505164538256690e+00
8 -5.6130490268747746e-01 +5.9960502445047581e-02 +1.2425308102650501e+00
22 -4.7031168681283519e+00 -1.4866179789189591e+00 +6.4329977784187857e+00
63 -1.9081574348421938e+01 -5.6305584192753786e+00 +2.6902031858293121e+01
7 +5.8016086062937777e-01 +1.0896938249318202e+00 +1.0190659286048849e+00
0 +1.0253545438881417e+01 +1.0253545438881417e+01 +0.0000000000000000e+00
5 +1.0871323777377295e-01 +3.6012080718820982e-01 +5.0281513882887374e-01
7 +3.5619491977679107e-01 +9.1621270316993719e-01 +1.1200355667862922e+00
0 +4.1014200837547570e+00 +4.1014200837547570e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -8.6873618265199930e+00 -2.6505171760394766e+00 +1.2073689300961032e+01
54 -1.6224994615039677e+01 -5.1746625676062212e+00 +2.2100664094866911e+01
18 -4.5215172544928395e+00 -2.2547668545408959e+00 +4.5335007999038872e+00
18 -3.0503700330491101e+00 -8.0720630674103289e-01 +4.4863274526161545e+00
5 +5.8582574879526561e-02 +3.6493540878393382e-01 +6.1270566780881452e-01
25 -6.9733140116971155e+00 -3.1034863034763469e+00 +7.7396554164415372e+00
15 -2.5025936523299910e+00 -6.9523024428651947e-01 +3.6147268160869430e+00
5 +8.0786088450220284e-01 +1.0851325629709074e+00 +5.5454335693740919e-01
0 +8.2691985451022951e+00 +8.2691985451022951e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.9439917368190862e+00 +8.9439917368190862e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -2.7701982669716685e-01 +8.3944868058894606e-01 +2.2329370145722258e+00
16 +1.6645420052293840e+00 +3.6132059006837456e+00 +3.8973277909087232e+00
17 -4.2279921819119410e+00 -2.1299991954245332e+00 +4.1959859729748157e+00
0 +5.4735579139588761e+00 +5.4735579139588761e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +5.2417101444202379e+00 +5.2417101444202379e+00 +0.0000000000000000e+00
10 +8.0610931785766571e-01 +1.7383915439886359e+00 +1.8645644522619405e+00
0 +6.5317507188945925e+00 +6.5317507188945925e+00 +0.0000000000000000e+00
99 -3.3176634407111457e+01 -6.2048925977727594e+00 +5.3943483618677398e+01
0 +9.2241116373635972e+00 +9.2241116373635972e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +7.0421664921981026e+00 +7.0421664921981026e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.2322421609594594e+00 -3.0907776287764221e-01 +1.8463287961636343e+00
15 -5.3961510722184336e-01 +1.2975139327884508e+00 +3.6742580800205884e+00
14 -2.9072386225207927e+00 -1.2692769639613632e+00 +3.2759233171188589e+00
28 -7.8564889853050071e+00 -3.3865507006528772e+00 +8.9398765693042606e+00
18 -3.6485330378701759e+00 -1.2474399791371424e+00 +4.8021861174660669e+00
7 -5.4955663167988700e-01 -9.6477835555973002e-02 +9.0615759224782799e-01
12 -4.5392808921571692e-01 +7.6793711457424907e-01 +2.4437304075799320e+00
40 -1.1517800488775020e+01 -4.2167799725608379e+00 +1.4602041032428364e+01
16 -3.9601734181906272e+00 -2.0652037591278667e+00 +3.7899393181255210e+00
54 -1.5250320335764563e+01 -4.4008431550872675e+00 +2.1698954361354591e+01
36 -1.0365917811914290e+01 -3.9422396480742119e+00 +1.2847356327680156e+01
1 +3.0986003703654137e+00 +3.1070907156615215e+00 +1.6980690592215630e-02
13 -1.6112672380173452e+00 -1.9937299450922330e-01 +2.8237884870162437e+00
0 +5.9327072336683333e+00 +5.9327072336683333e+00 +0.0000000000000000e+00
5 -1.1536342275959832e-01 +1.4957033405504294e-01 +5.2986751362928253e-01
0 +9.4473533195992498e+00 +9.4473533195992498e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +1.2298526077710132e+00 +1.7154178339471993e+00 +9.7113045235237205e-01
47 -1.2409792749027684e+01 -3.1737629860218575e+00 +1.8472059526011652e+01
29 -7.5360039561605019e+00 -2.8579502357819448e+00 +9.3561074407571141e+00
14 -6.9355418829951265e-01 +9.6648151950494299e-01 +3.3200714156089113e+00
16 -2.9490629426907615e+00 -1.0858325762519732e+00 +3.7264607328775767e+00
1 +1.4179200329325266e+00 +1.4221234178381739e+00 +8.4067698112946232e-03
37 -1.0702475234674058e+01 -3.9774630194365752e+00 +1.3450024430474965e+01
40 -1.1283161019960101e+01 -3.8012845123237775e+00 +1.4963753015272648e+01
0 +1.0122770861521364e+01 +1.0122770861521364e+01 +0.0000000000000000e+00
24 -1.9167801662675474e+00 +1.6864777352401115e+00 +7.2065158030153178e+00
0 +8.0608057827852768e+00 +8.0608057827852768e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.2852995772786366e+00 -1.9018654301170086e+00 +4.7668682943232561e+00
21 -3.2833633722164537e+00 -2.7099992758961822e-01 +6.0247268892536709e+00
2 +1.5012352645685096e+00 +1.5575394813161045e+00 +1.1260843349518979e-01
8 -1.2488053817540647e+00 -6.4812432294124900e-01 +1.2013621176256315e+00
32 -8.9595087221905487e+00 -3.6519922646765650e+00 +1.0615032915027967e+01
11 +1.2020524818013989e-01 +1.1669169510732664e+00 +2.0934234057862531e+00
33 -9.5395053219915944e+00 -3.8349505662896721e+00 +1.1409109511403845e+01
62 -1.8217802794875535e+01 -5.1828564290961063e+00 +2.6069892731558859e+01
9 +2.8918665079433659e-01 +9.9344885398075267e-01 +1.4085244063728322e+00
18 -4.5447745895626683e+00 -2.2385335689272328e+00 +4.6124820412708711e+00
6 -2.2522060068723082e-01 +1.3069529955327219e-01 +7.1183180048100603e-01
0 +6.2922155637704273e+00 +6.2922155637704273e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.0694598679607159e+00 -9.7517276423658839e-01 +4.1885742074482550e+00
40 -1.1630241794549921e+01 -4.2939068055100291e+00 +1.4672669978079783e+01
18 -4.1240492853488773e+00 -1.8385167691708197e+00 +4.5710650323561151e+00
16 -2.8989774748500574e+00 -8.9985404880907938e-01 +3.9982468520819561e+00
18 -4.6989974506312739e+00 -2.3570671893355630e+00 +4.6838605225914218e+00
0 +8.1543159398132392e+00 +8.1543159398132392e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -3.3574070342167124e+00 -9.9626228499164871e-01 +4.7222894984501274e+00
24 -5.1474780037766878e+00 -1.5349074255305504e+00 +7.2251411564922750e+00
12 -8.4223570570590578e-01 +3.2840701493665714e-01 +2.3412854412851258e+00
13 -2.3083667740166840e+00 -8.2479840457107700e-01 +2.9671367388912140e+00
18 -1.0630573703209274e+00 +1.3587895053515520e+00 +4.8436937513449587e+00
12 -5.7132264516139930e-01 +6.7596196199219527e-01 +2.4945692143071891e+00
0 +2.0596857067425747e+00 +2.0596857067425747e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.7202082967627694e+00 +1.7202082967627694e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.7829319802220942e+00 -9.1311642913039659e-01 +1.7396311021833952e+00
9 -8.8577809579452715e-01 -1.2894706640723275e-01 +1.5136620587745888e+00
4 +6.0238434104876415e+00 +6.1993353468217638e+00 +3.5098387266824460e-01
15 -2.5012557770550812e+00 -7.3037633430072058e-01 +3.5417588855087212e+00
17 -1.0227942471438283e+00 +1.0477948237330728e+00 +4.1411781417538016e+00
23 -6.0293452195778174e+00 -2.6625685218588808e+00 +6.7335533954378732e+00
5 +1.5412500175456483e+00 +1.8516506400496282e+00 +6.2080124500795986e-01
42 -1.1320367069757626e+01 -3.4911733138348922e+00 +1.5658387511845469e+01
19 -5.0652795239157209e+00 -2.4537601925133035e+00 +5.2230386628048349e+00
6 -3.5303378718842904e-01 +8.6044461619583679e-02 +8.7815649761602543e-01
9 -1.2312209924125739e+00 -4.2052733670385489e-01 +1.6213873114174380e+00
21 -4.0636039546567373e+00 -1.1346503138353001e+00 +5.8579072816428743e+00
52 -1.5392505117993675e+01 -5.0485889425913530e+00 +2.0687832350804644e+01
5 -2.1060203001871081e-01 +3.7226357195448756e-02 +4.9565677442831912e-01
0 +8.6644700709848443e+00 +8.6644700709848443e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +2.3368488379117696e+00 +2.8857487075354378e+00 +1.0977997392473364e+00
34 -9.8733130924056027e+00 -3.9232280453038126e+00 +1.1900170094203581e+01
30 -7.2153771968977223e+00 -2.3272691425589378e+00 +9.7762161086775698e+00
14 -3.3033510562049804e+00 -1.7907536150906087e+00 +3.0251948822287433e+00
52 -1.3002533924904451e+01 -2.6108093935991472e+00 +2.0783449062610607e+01
10 -1.7525835058473431e+00 -8.0688740592429209e-01 +1.8913921998461021e+00
12 +2.6988293073752625e+00 +3.9589431233105787e+00 +2.5202276318706325e+00
10 -1.5545146734979927e+00 -6.1128057662873037e-01 +1.8864681937385246e+00
14 -9.5903384824803428e-01 +5.7242754516122840e-01 +3.0629227868185254e+00
29 -4.5966817911406528e+00 +4.8704044607052355e-02 +9.2907716714954098e+00
32 -6.6668047830006296e+00 -1.1749964537163644e+00 +1.0983616658568531e+01
16 -2.2498471151436314e+00 -3.7510508600573722e-01 +3.7494840582757885e+00
0 +5.1449560451804732e+00 +5.1449560451804732e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1905714225986124e+00 +8.1905714225986124e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -8.9490319755544512e+00 -3.4908343082195818e+00 +1.0916395334669739e+01
10 +9.0537534917714257e-01 +1.8364119570036888e+00 +1.8620732156530924e+00
0 +3.8672183397598627e+00 +3.8672183397598627e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1504290614809580e+00 +8.1504290614809580e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -3.1632283817132665e+00 -6.0546545637073423e-01 +5.1155258506850645e+00
11 -8.4371489377040643e-01 +1.6583489892788528e-01 +2.0190995853965834e+00
3 +1.2030961729450036e+00 +1.2789103959787567e+00 +1.5162844606750614e-01
35 -9.6351354209459075e+00 -3.5429135154783626e+00 +1.2184443810935090e+01
8 -8.5103381542825129e-01 -1.9024182139079926e-01 +1.3215839880749041e+00
8 +4.7815917905074450e+00 +5.3796652696748932e+00 +1.1961469583348965e+00
0 +4.2135628531977503e+00 +4.2135628531977503e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.8807223386121068e+00 -2.0999889701467027e+00 +5.5614667369308082e+00
14 -2.8333720924381582e+00 -1.3206322073871735e+00 +3.0254797701019696e+00
18 -3.2352679896780225e+00 -9.9338292399791195e-01 +4.4837701313602212e+00
12 -1.9069114257710877e+00 -7.2239917008667653e-01 +2.3690245113688224e+00
0 +4.7708135185537435e+00 +4.7708135185537435e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -3.6066712806414687e+00 -8.3744616900093583e-01 +5.5384502232810657e+00
2 +4.1777704642319229e+00 +4.2178696538431533e+00 +8.0198379222460758e-02
27 -4.2800295243973343e+00 -8.3666063203748919e-02 +8.3927269223871708e+00
18 -4.1029687951601987e+00 -1.8487928566159999e+00 +4.5083518770883977e+00
2 +1.8128194909174331e+00 +1.8718771999999091e+00 +1.1811541816495197e-01
22 -5.8836469759906320e+00 -2.6461260316235107e+00 +6.4750418887342427e+00
0 +8.5569475887310755e+00 +8.5569475887310755e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -2.3892191029110412e+00 +3.4434092500705837e-02 +4.8473063908234941e+00
51 -1.2160406356735017e+01 -1.9853385045511929e+00 +2.0350135704367649e+01
2 +3.7683167128555493e+00 +3.7985557785543609e+00 +6.0478131397623258e-02
9 +7.0746419095720103e-01 +1.4549133939812990e+00 +1.4948984060481960e+00
34 -9.2439143241017945e+00 -3.3935456079103594e+00 +1.1700737432382869e+01
8 +1.5308488195066952e+00 +2.1866276414177683e+00 +1.3115576438221463e+00
7 +4.3651598810729464e+00 +4.9100981484445612e+00 +1.0898765347432295e+00
29 -8.2547914379505549e+00 -3.4987643218497562e+00 +9.5120542322015975e+00
0 +9.6953754170456126e+00 +9.6953754170456126e+00 +0.0000000000000000e+00
25 -3.1878782657624400e+00 +7.0280283117972919e-01 +7.7813621938843385e+00
24 -4.1504336306621274e+00 -6.6664389648016797e-01 +6.9675794683639189e+00
15 -3.2292739719895183e+00 -1.5061240794984161e+00 +3.4462997849822044e+00
21 -4.7314682197296500e+00 -1.7094542772780295e+00 +6.0440278849032412e+00
11 -2.5817172321322674e+00 -1.4516435900485867e+00 +2.2601472841673615e+00
0 +8.9715990333164974e+00 +8.9715990333164974e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.9873194300120716e+00 +8.9873194300120716e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.9071660766503795e+00 -2.4421881195841144e+00 +4.9299559141325302e+00
22 -5.7109852991148822e+00 -2.6220579521479683e+00 +6.1778546939338277e+00
21 -2.8944002432190148e+00 +1.3454036286320648e-01 +6.0578812121644425e+00
0 +8.1104586677297767e+00 +8.1104586677297767e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.8710963963951706e+00 +1.9743158033789321e+00 +2.0643881396752306e-01
0 +6.4141654906544376e+00 +6.4141654906544376e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -3.0348131924382100e+00 -1.5946492322804358e+00 +2.8803279203155485e+00
32 -6.0015623559071853e+00 -6.5270489976690182e-01 +1.0697714912280567e+01
12 -1.0851285393164778e+00 +1.4101209505869372e-01 +2.4522812687503430e+00
0 +7.7928466583211886e+00 +7.7928466583211886e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +9.8999431037530528e-01 +1.0985239183946121e+00 +2.1705921603861356e-01
21 -1.6042192790806995e+00 +1.2608119955051769e+00 +5.7300625491717527e+00
12 -1.9330779708355257e+00 -7.4346198956071419e-01 +2.3792319625496230e+00
16 -3.7424231744001988e+00 -1.7140932573287424e+00 +4.0566598341429128e+00
33 -8.2455980509706102e+00 -2.6588135846420959e+00 +1.1173568932657028e+01
2 +4.6609235180931528e+00 +4.6971036409566427e+00 +7.2360245726979855e-02
19 -3.0233510695933665e+00 -5.5516219447013748e-01 +4.9363777502464581e+00
48 -1.3714929876421511e+01 -4.3417603694154119e+00 +1.8746339014012200e+01
30 -7.6200120657896742e+00 -2.5732340499008806e+00 +1.0093556031777588e+01
1 +2.2336771591989271e+00 +2.2430748498472313e+00 +1.8795381296608404e-02
6 +1.1386860735905753e+00 +1.4979481263286845e+00 +7.1852410547621837e-01
8 -9.4408218833100133e-01 -2.5102695287884202e-01 +1.3861104709043186e+00
29 -6.6713888199188043e+00 -1.9228922767277894e+00 +9.4969930863820302e+00
0 +7.8240238308512478e+00 +7.8240238308512478e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -2.0208452283267926e+00 -1.1628141428826000e+00 +1.7160621708883852e+00
43 -1.2633180964809231e+01 -4.5361067258051504e+00 +1.6194148478008159e+01
21 -5.1985578797049277e+00 -2.1936924047249549e+00 +6.0097309499599456e+00
25 -6.5756363818770618e+00 -2.6704574230828890e+00 +7.8103579175883455e+00
0 +5.3448251851629909e+00 +5.3448251851629909e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -9.0655989717993979e-01 -4.0771405439085662e-01 +9.9769168557816634e-01
35 -9.3826700294144807e+00 -3.2733467568489685e+00 +1.2218646545131024e+01
13 -2.6598096272238854e+00 -1.2038092765255395e+00 +2.9120007013966918e+00
28 -7.2715067306490164e+00 -2.7059840540944120e+00 +9.1310453531092080e+00
23 -2.2446775919119490e+00 +1.0908904568356861e+00 +6.6711360974952703e+00
10 +1.5616951897440678e-01 +1.0221813855839610e+00 +1.7320237332191084e+00
32 -7.5095568726792221e+00 -2.0319501978151644e+00 +1.0955213349728115e+01
3 +2.5395182668814744e+00 +2.6816365176954751e+00 +2.8423650162800129e-01
3 +2.9652558698771929e+00 +3.0739519186011730e+00 +2.1739209744796018e-01
11 -2.5639669312290545e+00 -1.4338137769515633e+00 +2.2603063085549824e+00
34 -8.1125799141186050e+00 -2.1265063831130351e+00 +1.1972147062011139e+01
15 -3.3710353914830558e+00 -1.5908668422684209e+00 +3.5603370984292697e+00
16 -3.1020304218230601e+00 -1.1339970102588337e+00 +3.9360668231284528e+00
7 -1.1766579359123597e+00 -6.7677044120798246e-01 +9.9977498940875442e-01
9 -1.7434073645182506e+00 -1.0137749208464006e+00 +1.4592648873437000e+00
3 +2.0520787578006647e+00 +2.1373566213771924e+00 +1.7055572715305534e-01
4 +7.4871450735972545e-01 +9.2259591045968481e-01 +3.4776280619991873e-01
18 -3.9290206381673523e+00 -1.6520460736688731e+00 +4.5539491289969583e+00
5 +1.5343049364737000e+00 +1.7980598248341719e+00 +5.2750977672094379e-01
18 -4.4911072080034868e+00 -2.2108913693958456e+00 +4.5604316772152824e+00
0 +4.6386533716621630e+00 +4.6386533716621630e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +8.0874401526164696e-01 +8.1520138620904881e-01 +1.2914741894803683e-02
29 -4.9149606845369691e+00 -1.5880751061050935e-01 +9.5123063478529204e+00
37 -8.0357467759013481e+00 -1.5127717719992007e+00 +1.3045950007804295e+01
20 -4.3694976945211339e+00 -1.6060830818697718e+00 +5.5268292253027242e+00
6 -4.7231050362935179e-02 +3.0361968334640999e-01 +7.0170146741869033e-01
7 -1.3053247474675533e+00 -7.4963405957668883e-01 +1.1113813757817290e+00
16 -3.7231405987031083e+00 -1.8033375603361437e+00 +3.8396060767339293e+00
15 -1.4011042557305364e+00 +2.8088497751114794e-01 +3.3639784664833687e+00
18 -4.5740925742765297e+00 -2.3126167830384174e+00 +4.5229515824762245e+00
6 -6.6024000806399119e-01 -2.8593370052500955e-01 +7.4861261507796328e-01
7 -9.1194698145946340e-01 -4.0280092904326903e-01 +1.0182921048323887e+00
0 +9.7935879552521605e+00 +9.7935879552521605e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +4.3960940655707041e+00 +4.4026953335298860e+00 +1.3202535918363623e-02
22 -3.1171909066944474e+00 +1.2668794243462678e-02 +6.2597194018758202e+00
20 -5.2133225800247702e+00 -2.5377387095224617e+00 +5.3511677410046170e+00
0 +4.5546209322296880e+00 +4.5546209322296880e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -7.2384916701344881e-01 -1.5889922420520808e-01 +1.1298998856164815e+00
0 +4.4854036738848553e+00 +4.4854036738848553e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.8655648588180695e+00 +2.8655648588180695e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +7.6365671487041986e-02 +3.7647342302296050e-01 +6.0021550307183702e-01
62 -1.6700789505990535e+01 -3.5044440156181103e+00 +2.6392690980744849e+01
27 -7.3649275298169110e+00 -3.0191490669116350e+00 +8.6915569258105521e+00
36 -9.8751294357683825e+00 -3.4944596965189740e+00 +1.2761339478498817e+01
60 -1.7354480456466135e+01 -4.8412094388476765e+00 +2.5026542035236915e+01
27 -6.3290532368070069e+00 -2.1490483232046356e+00 +8.3600098272047418e+00
7 +3.3967345475436961e-01 +8.4036785490073296e-01 +1.0013888002927267e+00
8 +9.6228140650290506e-02 +7.6118876836179838e-01 +1.3299212554230158e+00
5 +3.8762235194521022e-01 +6.4985745465941491e-01 +5.2447020542840939e-01
28 -7.8389220280929850e+00 -3.3640950849162032e+00 +8.9496538863535626e+00
20 -4.8211999505984453e+00 -2.0286112570334622e+00 +5.5851773871299661e+00
31 -7.0008654050669294e+00 -1.7762054324633425e+00 +1.0449319945207174e+01
24 -6.4697387628344680e+00 -2.9274070753371007e+00 +7.0846633749947348e+00
9 +1.7682212776057060e-01 +9.4117309290576712e-01 +1.5287019302903930e+00
25 -6.8956286391727124e+00 -3.0922529582676206e+00 +7.6067513618101836e+00
11 -2.0983728791973997e+00 -1.0845009958977441e+00 +2.0277437665993112e+00
7 -1.0036778824299075e+00 -4.8971099973675081e-01 +1.0279337653863134e+00
0 +6.4999300361390171e+00 +6.4999300361390171e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -5.7083667482437663e+00 +5.2807695877435501e-02 +1.1522348888242403e+01
19 -8.4894775705432757e-01 +1.6203243444966611e+00 +4.9385442031019773e+00
31 -8.0994904254779776e+00 -2.9686706173552384e+00 +1.0261639616245478e+01
0 +3.8551178977365002e+00 +3.8551178977365002e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.1224254602563089e+01 -3.1786008029659607e+00 +1.6091307599194259e+01
17 -3.1015217685266707e+00 -1.0455709506748798e+00 +4.1119016357035818e+00
0 +4.8897250818951168e+00 +4.8897250818951168e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -1.2019333651352603e+01 -4.2560137540129386e+00 +1.5526639794679330e+01
25 -4.7974046930482865e+00 -8.9168810664379050e-01 +7.8114331728089921e+00
40 -1.0016040135779072e+01 -2.5989345553053722e+00 +1.4834211160947399e+01
17 -4.0822007285760469e+00 -2.0106141995482627e+00 +4.1431730580555683e+00
2 +3.0105207311323658e+00 +3.0807138393118203e+00 +1.4038621635890891e-01
36 -9.8360815302400688e+00 -3.5675269255215438e+00 +1.2537109209437050e+01
15 -3.7526287413658528e+00 -1.9860934762773650e+00 +3.5330705301769756e+00
13 -2.3180393779007806e+00 -8.7601138478913443e-01 +2.8840559862232924e+00
8 -1.5786803594565875e+00 -9.2031928227924453e-01 +1.3167221543546859e+00
1 +4.0782599236807275e+00 +4.0856047531634854e+00 +1.4689658965515662e-02
8 +2.5931449776371007e-01 +9.3969112446958514e-01 +1.3607532534117501e+00
16 -3.5396067016703716e+00 -1.5678645425304607e+00 +3.9434843182798218e+00
36 -1.0541962655856231e+01 -4.0821050578208888e+00 +1.2919715196070685e+01
0 +3.0651105399469105e+00 +3.0651105399469105e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +4.5110564798192954e-01 +7.5135175442362634e-01 +6.0049221288339361e-01
22 -5.8108514917032332e+00 -2.7274674767866465e+00 +6.1667680298331735e+00
12 -8.2060512981684752e-01 +4.4242177425771079e-01 +2.5260538081491166e+00
10 -9.6725646584689429e-01 -1.0009479912246633e-01 +1.7343233334488559e+00
21 -5.2543289596321410e+00 -2.3381918563619917e+00 +5.8322742065402986e+00
0 +7.0569372240268606e+00 +7.0569372240268606e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.6446967668276793e+00 -7.9576282924854702e-01 +1.6978678751582645e+00
14 -2.8496925849330639e+00 -1.3406954998997365e+00 +3.0179941700666548e+00
0 +5.1068839972466513e+00 +5.1068839972466513e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.7243500934456470e+00 +4.7243500934456470e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -4.8873107654907146e+00 -1.9354084509460283e+00 +5.9038046290893726e+00
53 -1.3848563397722007e+01 -3.2438614560941037e+00 +2.1209403883255806e+01
5 +2.0573951779381376e+00 +2.3208624241320055e+00 +5.2693449238773571e-01
27 -5.2556383509204965e+00 -1.0661201056955969e+00 +8.3790364904497991e+00
1 +4.0685934828909174e+00 +4.0707474560851473e+00 +4.3079463884598823e-03
5 +1.0331723326728994e+00 +1.3022424279576645e+00 +5.3814019056953022e-01
16 -1.6866958597107748e+00 +2.5608577794074838e-01 +3.8855632753030465e+00
25 -6.4082259013685290e+00 -2.6345859241746656e+00 +7.5472799543877267e+00
0 +4.3558672542142762e+00 +4.3558672542142762e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.8217189980479054e+00 -2.0595499132350041e+00 +5.5243381696258025e+00
0 +3.9794267011208966e+00 +3.9794267011208966e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +9.1975691171511809e+00 +9.1975691171511809e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -6.3747752863008982e+00 -2.7929213933379353e+00 +7.1637077859259257e+00
0 +3.8632937013674820e+00 +3.8632937013674820e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -1.3127955727822780e+00 -1.9928199608721719e-02 +2.5857347463471125e+00
1 +4.6096239761848414e+00 +4.6215804995011469e+00 +2.3913046632610957e-02
18 -2.4699614548529381e+00 -2.0335702276942769e-01 +4.5332088641670207e+00
11 -7.8499314094969552e-01 +3.1503463865640535e-01 +2.2000555592122018e+00
0 +1.4729182963966094e+00 +1.4729182963966094e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -1.0418414996909927e+01 -3.7058383489826268e+00 +1.3425153295854601e+01
7 +1.1722422050815320e+00 +1.7316056724697066e+00 +1.1187269347763493e+00
0 +3.3430221956800894e+00 +3.3430221956800894e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.0743494779379727e+01 -2.7071468077797167e+00 +1.6072695943200021e+01
9 -1.2181982633285555e+00 -4.2748882999134086e-01 +1.5814188666744293e+00
9 -1.0896183975711162e+00 -3.7505376557068359e-01 +1.4291292640008653e+00
18 -4.5496787849762894e+00 -2.1636893291136960e+00 +4.7719789117251867e+00
11 +3.2426007011330986e+00 +4.3760817852989033e+00 +2.2669621683316095e+00
10 -2.1149601687458377e+00 -1.2047769776925152e+00 +1.8203663821066449e+00
2 +2.1555663217100332e+00 +2.2117428322907715e+00 +1.1235302116147672e-01
0 +1.2586076586817869e+00 +1.2586076586817869e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -2.5311630271085326e+00 -8.8724752176313837e-01 +3.2878310106907884e+00
2 +7.6347097419186216e-01 +8.1875867871428376e-01 +1.1057540904484320e-01
0 +4.9012028177244673e+00 +4.9012028177244673e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.1314976835749322e+00 -9.6832312220529904e-01 +2.3263491227392663e+00
19 -3.1548820200601861e+00 -5.8354629670210523e-01 +5.1426714467161618e+00
18 -4.3035369978859075e+00 -1.9700600389502974e+00 +4.6669539178712203e+00
56 -1.4223083959890062e+01 -2.6498670214201141e+00 +2.3146433876939895e+01
0 +1.7037020782515135e+00 +1.7037020782515135e+00 +0.0000000000000000e+00
50 -1.4729465141135677e+01 -4.7317227463532241e+00 +1.9995484789564905e+01
2 +6.6734084974874275e-01 +7.2865487803833151e-01 +1.2262805657917752e-01
40 -1.1162822174860956e+01 -3.8406606189626680e+00 +1.4644323111796577e+01
14 -1.7163225705716361e+00 -1.9620336808107197e-01 +3.0402384049811282e+00
11 -2.2439948497260973e+00 -1.2396601825197351e+00 +2.0086693344127244e+00
11 -4.7783585864930611e-01 +6.6260329292882592e-01 +2.2808783031562641e+00
15 -3.0411815209082311e+00 -1.2330523941691767e+00 +3.6162582534781089e+00
16 -2.9738515691981080e+00 -9.5604720933753651e-01 +4.0356087197211430e+00
17 -2.9992930664102788e+00 -7.9962157377335386e-01 +4.3993429852738499e+00
20 -2.4362387468307043e+00 +3.0633282476568180e-01 +5.4851431431927722e+00
9 -1.4483151433452690e-01 +6.5855142085699958e-01 +1.6067658703830530e+00
1 +8.5687313971966805e-01 +8.6885708493782676e-01 +2.3967890436317418e-02
22 -6.0236562020511579e+00 -2.8315889104930179e+00 +6.3841345831162801e+00
4 -7.2095760164913258e-02 +1.4577357566653681e-01 +4.3573867166290015e-01
10 -2.8114812408808110e-01 +6.6609168228123306e-01 +1.8944796127386283e+00
0 +6.1696695157883621e+00 +6.1696695157883621e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.6607967322930550e+00 +1.6607967322930550e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.2066006691376678e+00 +4.2066006691376678e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +7.0060441602186412e+00 +7.0060441602186412e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.0254890803356719e+01 -1.6400074201010377e+00 +1.7229766766511364e+01
2 +4.7071571224020552e+00 +4.7656057784606736e+00 +1.1689731211723675e-01
5 -4.9702377128067976e-01 -1.8805298770715861e-01 +6.1794156714704229e-01
8 -1.4104304105045653e+00 -8.1450109852117336e-01 +1.1918586239667839e+00
23 -5.5393731015677554e+00 -2.0863351507444161e+00 +6.9060759016466786e+00
16 -3.5305103261269979e+00 -1.5727463657613416e+00 +3.9155279207313125e+00
0 +5.3386738421558464e+00 +5.3386738421558464e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.4824446130924844e+00 +1.5994474798996055e+00 +2.3400573361424204e-01
45 -1.2694325468714663e+01 -4.0384972331913813e+00 +1.7311656471046561e+01
8 +2.7875947744836540e+00 +3.3773612425818649e+00 +1.1795329361964217e+00
9 -2.0468804083383940e-01 +6.0485890708047663e-01 +1.6190938958286321e+00
9 -1.5817905150728055e+00 -8.2630235789766182e-01 +1.5109763143502875e+00
0 +3.1307926311425929e+00 +3.1307926311425929e+00 +0.0000000000000000e+00
23 -6.0729227668342558e+00 -2.6318535962435590e+00 +6.8821383411813937e+00
25 -6.2550299294779395e+00 -2.5315484119326084e+00 +7.4469630350906622e+00
10 -1.0353240492794606e+00 -6.1362708336367255e-02 +1.9479226818861868e+00
16 -3.9586793521291606e+00 -1.9661674227737924e+00 +3.9850238587107363e+00
5 -5.5777899361549288e-01 -2.3727381855260088e-01 +6.4101035012578400e-01
8 +9.9314809682379934e-01 +1.6637079003694870e+00 +1.3411196070913753e+00
0 +3.7298719157210876e+00 +3.7298719157210876e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.5225782453000054e+00 +4.5225782453000054e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.0445764047008872e+01 -1.7748935565302140e+00 +1.7341740980957315e+01
27 -4.4122147635776114e+00 -2.5756522199358312e-01 +8.3092990831680567e+00
13 -3.1153443936819523e+00 -1.7052971612887649e+00 +2.8200944647863748e+00
22 -5.4384638355675063e+00 -2.2684872035060994e+00 +6.3399532641228138e+00
0 +4.1304561725669027e+00 +4.1304561725669027e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +2.1814258687494439e+00 +2.4078433172578810e+00 +4.5283489701687429e-01
0 +9.2260494677632146e+00 +9.2260494677632146e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -2.9716819660293483e+00 -6.1666856467019038e-01 +4.7100268027183159e+00
3 +3.2851525805564208e+00 +3.3724387031630974e+00 +1.7457224521335313e-01
15 -3.7922759133465176e+00 -1.9628911141822907e+00 +3.6587695983284538e+00
14 -3.2914257969220069e+00 -1.7846669156932928e+00 +3.0135177624574281e+00
0 +9.1162298198734444e+00 +9.1162298198734444e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.7978275090756108e+00 -2.3893034958869643e+00 +4.8170480263772930e+00
23 -5.3003618410612185e+00 -1.8550612546335215e+00 +6.8906011728553942e+00
0 +6.7486288468239852e+00 +6.7486288468239852e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -3.9535286299348451e+00 -1.9935704399613741e+00 +3.9199163799469421e+00
21 -4.8362770998768747e+00 -1.8576190938104937e+00 +5.9573160121327620e+00
14 +4.2829422241340875e-01 +2.0154918172388703e+00 +3.1743951896509230e+00
7 -1.0546399510511177e+00 -5.5847002664135914e-01 +9.9233984881951720e-01
13 -1.5474269934381342e+00 -1.2699994717769458e-01 +2.8408540925208792e+00
14 -2.5437557305870486e+00 -8.8700470045354463e-01 +3.3135020602670080e+00
43 -1.2277861001160144e+01 -4.2633955489132553e+00 +1.6028930904493777e+01
0 +2.4162536641532273e+00 +2.4162536641532273e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.3185755803126948e+00 +6.3185755803126948e+00 +0.0000000000000000e+00
49 -1.2339409098923994e+01 -2.6953739946357329e+00 +1.9288070208576521e+01
4 +3.3648468608759083e+00 +3.5686497957832111e+00 +4.0760586981460545e-01
25 -7.0387930005229444e+00 -3.1362646230936000e+00 +7.8050567548586889e+00
0 +8.1620946674825756e+00 +8.1620946674825756e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.3182191115572506e+00 -2.7162139755907067e-01 +4.0931954279963598e+00
1 +2.5264694774584115e+00 +2.5379098507467788e+00 +2.2880746576734445e-02
18 -2.2200434172774832e+00 +1.4158649037451054e-01 +4.7232598153039875e+00
3 +7.7804462256593698e-01 +8.8431378407022798e-01 +2.1253832300858200e-01
7 -1.9571301704600330e-01 +2.8803960201430012e-01 +9.6750523812060685e-01
7 +2.3879010112410004e-01 +7.0891639161583520e-01 +9.4025258098347031e-01
19 -4.5559099553123472e+00 -2.0823967890281527e+00 +4.9470263325683890e+00
2 +3.0916309726736007e+00 +3.1400729308077695e+00 +9.6883916268337700e-02
8 -1.0325867836155176e+00 -3.3562216970071557e-01 +1.3939292278296040e+00
12 -2.4770848184964818e+00 -1.3221799825106233e+00 +2.3098096719717169e+00
0 +4.3735865109596173e+00 +4.3735865109596173e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +7.9914692980467716e-01 +8.0752308669687345e-01 +1.6752313784392570e-02
4 +1.5027018452786844e-01 +3.6421977791074678e-01 +4.2789918676575667e-01
0 +6.7869625789012487e+00 +6.7869625789012487e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.2072193146354584e+00 -1.4347670884736474e+00 +3.5449044523236219e+00
0 +1.3716518184563210e+01 +1.3716518184563210e+01 +0.0000000000000000e+00
7 +9.8893605477497903e-01 +1.5362155315340402e+00 +1.0945589535181224e+00
11 -1.3045864785595525e+00 -2.7062559342166814e-01 +2.0679217702757686e+00
16 -7.0466762502762048e-01 +1.2130454776643136e+00 +3.8354262053838681e+00
13 -1.7575674451290819e+00 -3.2350400185046890e-01 +2.8681268865572260e+00
9 -9.5088597691316856e-01 -1.7491319847840625e-01 +1.5519455568695246e+00
23 -5.2088747586294408e+00 -1.9127396104201271e+00 +6.5922702964186275e+00
44 -1.3100568919385491e+01 -4.6269222225232820e+00 +1.6947293393724419e+01
4 +1.1060067166124989e+00 +1.2870276357325445e+00 +3.6204183824009117e-01
2 +9.2414047197593607e-01 +9.7592124800145275e-01 +1.0356155205103335e-01
2 +4.6600001635782258e+00 +4.7314347328682285e+00 +1.4286913858000538e-01
1 +5.4271795000974032e+00 +5.4373990532452137e+00 +2.0439106295620846e-02
5 +2.2315480643544419e+00 +2.4909600932252336e+00 +5.1882405774158347e-01
12 -1.4575939184016624e+00 -1.6909873115470742e-01 +2.5769903744939100e+00
15 -3.0354404477280186e+00 -1.3348761778711418e+00 +3.4011285397137536e+00
19 -4.8794447028265671e+00 -2.3919912674822439e+00 +4.9749068706886463e+00
16 -3.8976502622885834e+00 -1.8573618286164182e+00 +4.0805768673443303e+00
23 -5.1366622570254181e+00 -1.8215183515357043e+00 +6.6302878109794277e+00
3 -1.9254825518316032e-02 +1.1898932983619392e-01 +2.7648831070901991e-01
13 -3.0318362834040355e+00 -1.6432834971165557e+00 +2.7771055725749596e+00
22 -5.3628782416830569e+00 -2.1801113628150084e+00 +6.3655337577360971e+00
14 -3.1564352738581354e+00 -1.5433453794932119e+00 +3.2261797887298469e+00
34 -9.7435145491862123e+00 -3.8833446942106202e+00 +1.1720339709951183e+01
0 +4.1600984972534345e+00 +4.1600984972534345e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -1.0568222208500515e+01 -4.0134521631875009e+00 +1.3109540090626028e+01
50 -1.4777683104073571e+01 -4.7750176375725495e+00 +2.0005330933002043e+01
20 -3.4718486994765163e+00 -7.2240090027320658e-01 +5.4988955984066195e+00
14 -2.2878115021119845e+00 -6.4315174338721448e-01 +3.2893195174495400e+00
9 +5.0934264924144657e-01 +1.2681756180195052e+00 +1.5176659375561172e+00
16 -4.1062922900082279e+00 -2.1286485835279345e+00 +3.9552874129605868e+00
22 -3.5769965347217552e+00 -4.2120545726068670e-01 +6.3115821549221369e+00
10 +5.8761596598834220e-01 +1.4546577402776224e+00 +1.7340835485785604e+00
27 -7.1634153710494912e+00 -3.0071987054814331e+00 +8.3124333311361163e+00
31 -8.2097265931392620e+00 -2.9469649423535511e+00 +1.0525523301571422e+01
10 -8.7048884801850157e-01 -2.3669177795400120e-02 +1.6936393404462029e+00
32 -8.5498947054146406e+00 -3.1770205851965905e+00 +1.0745748240436100e+01
0 +8.2050550311085715e+00 +8.2050550311085715e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -2.0157955986719065e+00 -3.8858114644363972e-01 +3.2544289044565335e+00
0 +1.4722855456748235e+01 +1.4722855456748235e+01 +0.0000000000000000e+00
2 +3.1527948920864897e+00 +3.2262471822801615e+00 +1.4690458038734366e-01
11 -2.2140908824698498e+00 -1.0628240259018753e+00 +2.3025337131359489e+00
5 -1.8417938957727298e-01 +5.3178695747466698e-02 +4.7471617064947935e-01
0 +1.0068934534850692e+01 +1.0068934534850692e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +1.9602781965137277e+00 +1.9602781965137277e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.7747871607880708e+00 +8.7747871607880708e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.8842645385229627e+01 +1.8842645385229627e+01 +0.0000000000000000e+00
15 -2.1294867500139700e+00 -2.8345940567526728e-01 +3.6920546886774055e+00
23 -5.6613704764009212e+00 -2.3410725515948867e+00 +6.6405958496120689e+00
0 +6.4360355124212818e+00 +6.4360355124212818e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -3.6647733985369157e-01 +4.7773559613470296e-01 +1.6884258719767891e+00
7 -4.9008557252405005e-01 -2.7095388279004595e-02 +9.2598036849009091e-01
15 -2.5351375230961510e+00 -7.0435657231603654e-01 +3.6615619015602290e+00
0 +8.7857682776656194e+00 +8.7857682776656194e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +3.3802426815063491e-01 +5.9531890851990887e-01 +5.1458928073854793e-01
27 -7.3226240365165092e+00 -3.1342377563623787e+00 +8.3767725603082610e+00
8 -8.4411242813162790e-01 -2.7773775623903241e-01 +1.1327493437851910e+00
29 -7.8355268390989581e+00 -3.2295595628530611e+00 +9.2119345524917939e+00
13 -1.1226222026988086e+00 +2.2229223747827742e-01 +2.6898288803541721e+00
3 +2.2541412014664086e-01 +3.0551310501801510e-01 +1.6019796974274847e-01
0 +2.0670880186367633e+00 +2.0670880186367633e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +9.1962231402055838e-01 +1.7593584334116410e+00 +1.6794722387821652e+00
5 +3.7428262927258018e+00 +4.0013665458035614e+00 +5.1708050615551926e-01
18 -4.5540520402221807e+00 -2.2934417651760119e+00 +4.5212205500923375e+00
0 +6.1791640125929286e+00 +6.1791640125929286e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.3925558261047870e+00 -1.7808018365110132e+00 +3.2235079791875476e+00
1 +1.1575695200733032e+00 +1.1689331733409718e+00 +2.2727306535337277e-02
21 -4.1142310474495440e+00 -1.2086602334855967e+00 +5.8111416279278947e+00
3 +2.6657390650749768e+00 +2.7658504054531603e+00 +2.0022268075636696e-01
17 -4.5366773030060736e+00 -2.3025137509437075e+00 +4.4683271041247323e+00
3 +4.0997011886608004e-01 +5.1875070923966948e-01 +2.1756118074717889e-01
2 +2.8702903367033508e+00 +2.9144694998940208e+00 +8.8358326381340113e-02
15 -2.5374171466355682e+00 -8.1322182150115419e-01 +3.4483906502688280e+00
20 -5.3015191778160071e+00 -2.5292804827440567e+00 +5.5444773901439008e+00
0 +4.5876557361430663e+00 +4.5876557361430663e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -1.1150077732497010e+00 +5.9630471028270104e-01 +3.4226249670648041e+00
0 +4.3017555472426032e+00 +4.3017555472426032e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.6683084600408149e+00 -1.4401853392231629e+00 +2.4562462416353039e+00
21 -1.5868160687529675e+00 +1.3523392760977098e+00 +5.8783106897013546e+00
10 -3.6195761947098859e-01 +5.2879448456946099e-01 +1.7815042080808992e+00
0 +4.1823142912031503e+00 +4.1823142912031503e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.0838074826855539e+00 +8.0838074826855539e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -2.6147589997248746e+00 -1.2734097580194459e+00 +2.6826984834108574e+00
14 +7.2704716164044392e-02 +1.5652002480163814e+00 +2.9849910637046739e+00
33 -9.5176165479967629e+00 -3.8044109243447171e+00 +1.1426411247304092e+01
4 +1.4835560995026036e+00 +1.6751644377313872e+00 +3.8321667645756730e-01
5 +1.4286124036996171e+00 +1.7526299908760152e+00 +6.4803517435279634e-01
24 -5.1630120795646564e+00 -1.6369468600227481e+00 +7.0521304390838164e+00
0 +1.4525893984320856e+01 +1.4525893984320856e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +1.3149893287816276e+01 +1.3149893287816276e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +6.4669533387510327e+00 +6.4669533387510327e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.9703752327536370e+00 +2.9703752327536370e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.4464735114349210e+01 +1.4464735114349210e+01 +0.0000000000000000e+00
36 -1.0138421161290768e+01 -3.8724289387959132e+00 +1.2531984444989710e+01
30 -8.2665803505427036e+00 -3.2247878400113570e+00 +1.0083585021062692e+01
5 -4.4257847053748023e-01 -1.9585479447538123e-01 +4.9344735212419799e-01
0 +2.4942536607255157e+00 +2.4942536607255157e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +9.9265680289679104e+00 +9.9265680289679104e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.5804680802410771e+00 +3.5804680802410771e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.0916289734196958e+01 -2.9031783692302762e+00 +1.6026222729933366e+01
27 -6.4513948274166895e+00 -2.2766060108903536e+00 +8.3495776330526716e+00
5 -3.0225916485232940e-01 -9.7134960914599944e-03 +5.8509133752173881e-01
2 +6.1025205760690149e+00 +6.1402656304949836e+00 +7.5490108851937521e-02
16 -3.1892414835614877e+00 -1.2394218818103955e+00 +3.8996392035021845e+00
11 -1.6251997280545556e+00 -6.1161681849615768e-01 +2.0271658191167958e+00
2 +1.0581304295791911e+00 +1.1181564001214870e+00 +1.2005194108459172e-01
0 +3.3346921474698341e+00 +3.3346921474698341e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +1.6783373192574587e+00 +2.0272775378252765e+00 +6.9788043713563574e-01
23 -5.9914493828586641e+00 -2.7289998387128804e+00 +6.5248990882915674e+00
0 +2.8540138337821066e+00 +2.8540138337821066e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -5.1633650270024356e+00 -2.3132175959534913e+00 +5.7002948620978886e+00
21 -5.4226497623726866e+00 -2.3979508876518207e+00 +6.0493977494417317e+00
35 -9.7406199157597513e+00 -3.6642151703304364e+00 +1.2152809490858630e+01
9 -1.7833171240551771e+00 -1.0183359388973345e+00 +1.5299623703156850e+00
5 +2.2129485913800462e+00 +2.5075750145409721e+00 +5.8925284632185182e-01
4 +1.6680713840462387e+00 +1.8941482613507628e+00 +4.5215375460904816e-01
54 -1.6051282163548972e+01 -5.1466131476382184e+00 +2.1809338031821508e+01
67 -2.0114519879146055e+01 -5.6758845315065720e+00 +2.8877270695278966e+01
0 +5.7457599936138024e+00 +5.7457599936138024e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -7.8295092576238812e-01 +1.6891033217593820e-01 +1.9037225158766526e+00
34 -8.2824221774225286e+00 -2.3343566993351077e+00 +1.1896130956174842e+01
16 -1.3496872861323137e+00 +5.2176243232652642e-01 +3.7428994369176802e+00
0 +4.8802680337795650e+00 +4.8802680337795650e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -4.6697383337851557e+00 -1.0228017971587282e+00 +7.2938730732528549e+00
0 +2.7526671326832073e+00 +2.7526671326832073e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.1223456075130125e+00 -1.8282938337194512e+00 +4.5881035475871226e+00
23 -3.2720676136587370e+00 +3.8123158160483506e-02 +6.6203815436384410e+00
4 +2.1699926264688938e+00 +2.3827931437299554e+00 +4.2560103452212328e-01
17 -4.5320245846680516e+00 -2.2987913101309196e+00 +4.4664665490742639e+00
23 -4.6222978052551094e+00 -1.2075238723916861e+00 +6.8295478657268465e+00
5 +3.4479800679986674e+00 +3.7095510226031103e+00 +5.2314190920888581e-01
4 -3.0886376092832357e-01 -1.0263590371306730e-01 +4.1245571443051254e-01
13 -2.3658398988990559e-01 +1.1511398846954184e+00 +2.7754477491706480e+00
0 +7.7041379267503043e+00 +7.7041379267503043e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -9.8025726447463377e+00 -3.1658875434560274e+00 +1.3273370202580621e+01
35 -7.0761783949685197e+00 -8.7122254973692903e-01 +1.2409911690463181e+01
3 +1.4707509002585937e+00 +1.6102560854055143e+00 +2.7901037029384135e-01
22 -1.5779951776999779e+00 +1.6580785172024752e+00 +6.4721473898049062e+00
11 +2.3429160380460790e-01 +1.2302149964722715e+00 +1.9918467853353272e+00
13 -1.4152657475626338e+00 -8.3611076187914968e-02 +2.6633093427494376e+00
0 +9.7792271011333121e+00 +9.7792271011333121e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.0944287513357676e-01 +5.3375870605526021e-01 +1.2864031623776739e+00
27 -5.5393184579528425e+00 -1.2261001085465661e+00 +8.6264366988125527e+00
9 +3.1579846250078454e+00 +3.9883597875050367e+00 +1.6607503249943827e+00
29 -8.1349469818559648e+00 -3.3769396973670496e+00 +9.5160145689778304e+00
6 +1.2035983978734874e+00 +1.5501637243293502e+00 +6.9313065291172560e-01
0 +4.0302058865692238e+00 +4.0302058865692238e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -8.8355323823497791e+00 -3.2449093210399953e+00 +1.1181246122619568e+01
0 +2.9145941737887822e+00 +2.9145941737887822e+00 +0.0000000000000000e+00
38 -1.0766727018523202e+01 -3.9134513459675917e+00 +1.3706551345111221e+01
5 -4.7170319901700619e-01 -1.9749812840945768e-01 +5.4841014121509701e-01
16 -2.2834707057894326e+00 -2.4543695000594834e-01 +4.0760675115669684e+00
6 +4.6264355552866743e-01 +8.0734043282944334e-01 +6.8939375460155183e-01
16 -3.4690434282374225e+00 -1.5277051174034231e+00 +3.8826766216679989e+00
7 +5.2942895128096268e-01 +1.0581143538295925e+00 +1.0573708050972597e+00
0 +7.8334003005864936e+00 +7.8334003005864936e+00 +0.0000000000000000e+00
6 -8.2654088390678027e-01 -4.4426570361605933e-01 +7.6455036058144188e-01
1 +3.0340805806613078e+00 +3.0465277967505848e+00 +2.4894432178554027e-02
25 -5.9376688639666524e+00 -2.1735340308605315e+00 +7.5282696662122417e+00
20 -5.0316966399873992e+00 -2.2519900113088744e+00 +5.5594132573570496e+00
8 -5.6585266912727672e-01 +1.2511288696619527e-01 +1.3819311121869440e+00
7 -1.1422872551535583e+00 -6.1454650490654483e-01 +1.0554815004940270e+00
14 -8.1451171704838288e-04 +1.5750358995272573e+00 +3.1517008224886114e+00
0 +2.7468731284373296e+00 +2.7468731284373296e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -6.9254518642869831e+00 -2.1625004913443071e+00 +9.5259027458853520e+00
8 +4.3353087044014655e+00 +4.9969108419421673e+00 +1.3232042750814035e+00
0 +1.8714639349169236e+01 +1.8714639349169236e+01 +0.0000000000000000e+00
15 -3.7393429473863753e+00 -1.9098924601174621e+00 +3.6589009745378265e+00
23 -5.4999116996675328e+00 -2.0306813659599952e+00 +6.9384606674150753e+00
24 -6.6316927093052280e+00 -3.0207976025502647e+00 +7.2217902135099266e+00
47 -1.2732911970616801e+01 -3.5754144892088440e+00 +1.8314994962815913e+01
38 -8.1789682031470292e+00 -1.3630334788692791e+00 +1.3631869448555500e+01
21 -4.7229256541844746e+00 -1.7257982588568246e+00 +5.9942547906553001e+00
0 +3.4167464952641353e+00 +3.4167464952641353e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +4.9733622637827146e-01 +9.0348050902108135e-01 +8.1228856528561977e-01
1 +5.8801102087645685e+00 +5.8958136974506967e+00 +3.1406977372256506e-02
5 +2.2646689466437495e+00 +2.5534327373762902e+00 +5.7752758146508132e-01
22 -5.6830871567212613e+00 -2.5686939946946987e+00 +6.2287863240531252e+00
10 -1.4693651228220261e-01 +7.9073685107687997e-01 +1.8753467267181652e+00
47 -1.4044601225856105e+01 -4.7859733249834591e+00 +1.8517255801745293e+01
2 +2.1952502038541506e+00 +2.2222756824226906e+00 +5.4050957137079969e-02
27 -6.2876438002933677e+00 -2.0283460660154571e+00 +8.5185954685558212e+00
5 +4.1671354830319824e+00 +4.4128009398726720e+00 +4.9133091368137904e-01
2 +4.8313852800576420e+00 +4.8934314949756885e+00 +1.2409242983609303e-01
41 -1.1765561034946906e+01 -4.0616410837337451e+00 +1.5407839902426321e+01
4 +1.0778168035712854e+00 +1.2845243526786092e+00 +4.1341509821464761e-01
7 +6.2543248596720336e-01 +1.1260608586804461e+00 +1.0012567454264856e+00
3 +3.6081585749488170e+00 +3.6983308299956459e+00 +1.8034451009365782e-01
41 -1.1044991098672075e+01 -3.5524920357746557e+00 +1.4984998125794839e+01
17 -9.4016515964065395e-01 +1.1433883667167308e+00 +4.1671070527147691e+00
7 +1.6785107229975891e+00 +2.1732209031189766e+00 +9.8942036024277513e-01
0 +4.0769474455233992e+00 +4.0769474455233992e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +1.3593422009623284e+00 +1.4068891197329583e+00 +9.5093837541259774e-02
14 -2.1959113524856546e+00 -6.0333147596205272e-01 +3.1851597530472038e+00
16 -4.1410588341346726e+00 -2.1020985307884548e+00 +4.0779206066924356e+00
0 +9.3455850912338114e+00 +9.3455850912338114e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -6.8571799013038959e-01 +2.6925714210943363e-01 +1.9099502644796464e+00
0 +9.0186320671083067e+00 +9.0186320671083067e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +7.7797098055758696e-01 +1.0638485952113159e+00 +5.7175522930745792e-01
74 -2.2248428921359739e+01 -5.8612469973752139e+00 +3.2774363847969049e+01
0 +1.3811663249049396e+01 +1.3811663249049396e+01 +0.0000000000000000e+00
36 -9.2086106740758495e+00 -2.9178638562511283e+00 +1.2581493635649442e+01
8 +9.4225476395823993e-01 +1.6006469860624208e+00 +1.3167844442083618e+00
37 -1.0654529415662051e+01 -4.0628477110719574e+00 +1.3183363409180187e+01
0 +7.9100478949339195e+00 +7.9100478949339195e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -8.8395025945975902e+00 -9.9302570927150546e-01 +1.5692953770652169e+01
4 +1.2507423495264289e+00 +1.4485609154110968e+00 +3.9563713176933568e-01
1 +1.0839426346104251e+00 +1.1043951868900663e+00 +4.0905104559282535e-02
26 -5.9120092821317582e+00 -1.9037187608936528e+00 +8.0165810424762114e+00
24 -5.6690404727725889e+00 -1.9768077035877205e+00 +7.3844655383697368e+00
13 -3.0447409372884673e+00 -1.6615858441146014e+00 +2.7663101863477317e+00
0 +5.0714361072939962e+00 +5.0714361072939962e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -9.9823501993719681e+00 -3.9496494303269687e+00 +1.2065401538089999e+01
22 -6.0318232421593345e+00 -2.8352556166294880e+00 +6.3931352510596930e+00
0 +6.7625125658191330e+00 +6.7625125658191330e+00 +0.0000000000000000e+00
80 -2.2191987361149096e+01 -3.9956921495618953e+00 +3.6392590423174397e+01
23 -6.2574290540540760e+00 -2.8675410837049053e+00 +6.7797759406983413e+00
4 +1.7464802102668209e-02 +1.7804745252707921e-01 +3.2116530084882200e-01
64 -1.5716699077542735e+01 -2.0755086827111691e+00 +2.7282380789663133e+01
6 +8.8211487269457933e-01 +1.2185567865469555e+00 +6.7288382770475241e-01
2 +3.5029063538311878e+00 +3.5553931974219957e+00 +1.0497368718161582e-01
7 -5.9630637077840998e-01 -8.7330050033417983e-02 +1.0179526414899840e+00
1 +7.4725932119582836e+00 +7.4989043235395503e+00 +5.2622223162533288e-02
0 +4.8205945191948754e+00 +4.8205945191948754e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +3.3671569592336859e-01 +6.3781041561116059e-01 +6.0218943937558400e-01
11 +3.5781079459181875e-01 +1.3596943806099597e+00 +2.0037671720362820e+00
11 -1.7313821091096537e+00 -5.8389658697769597e-01 +2.2949710442639155e+00
30 -5.6514462404349883e+00 -7.8532380516951283e-01 +9.7322448705309519e+00
21 -5.7791955030386548e+00 -2.7526610517038219e+00 +6.0530689026696658e+00
25 -6.7830739940375109e+00 -2.9424114558153698e+00 +7.6813250764442822e+00
8 +1.4133122461575072e+00 +2.0946674085905954e+00 +1.3627103248661765e+00
16 -2.2890641103376916e+00 -4.2393448664685529e-01 +3.7302592473816727e+00
25 -6.7918458569753026e+00 -2.9491366079032759e+00 +7.6854184981440534e+00
14 -2.0201468699970144e+00 -4.5234864519248008e-01 +3.1355964496090687e+00
10 +2.9951932769556380e+00 +3.8948563230956155e+00 +1.7993260922799550e+00
0 +3.4814183142875836e+00 +3.4814183142875836e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.5048366949714209e+00 +1.5879353465911006e+00 +1.6619730323935933e-01
24 -4.2802093807049291e+00 -7.4827427011177550e-01 +7.0638702211863071e+00
46 -1.3697496324389753e+01 -4.7199131064440945e+00 +1.7955166435891318e+01
11 -2.4757206940253562e+00 -1.3595275943310892e+00 +2.2323861993885341e+00
6 +2.4147242999567302e+00 +2.8375662788568254e+00 +8.4568395780019046e-01
18 -3.5679903710967080e+00 -1.2277633486121426e+00 +4.6804540449691308e+00
32 -8.6769304434137240e+00 -3.2343007817180540e+00 +1.0885259323391340e+01
42 -1.2375865047516189e+01 -4.4352089485138295e+00 +1.5881312198004720e+01
24 -6.4946155908039058e+00 -2.9829132035513348e+00 +7.0234047745051420e+00
0 +4.1469825719464302e+00 +4.1469825719464302e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +6.0632120194017247e-01 +9.1242215881878819e-01 +6.1220191375723143e-01
0 +8.2591808581019990e+00 +8.2591808581019990e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -2.8696368888656059e+00 -1.4377654511488243e+00 +2.8637428754335632e+00
7 -4.8300533165541726e-01 -1.5466369186780682e-02 +9.3507792493727315e-01
0 +8.4464242233881706e+00 +8.4464242233881706e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.1944462228882022e+00 -5.3079790574397112e-01 +1.3272966342884622e+00
3 +3.1024058488532900e+00 +3.2344732628659774e+00 +2.6413482802537480e-01
12 -2.6536738180972934e+00 -1.3450382811181969e+00 +2.6172710739581930e+00
29 -7.6333024892156311e+00 -2.9769389882945099e+00 +9.3127270018422426e+00
48 -1.3896336080016713e+01 -4.6085891813301529e+00 +1.8575493797373120e+01
0 +9.1996956153213620e+00 +9.1996956153213620e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.2916746174252163e+00 -1.4646513740810145e+00 +3.6540464866884035e+00
13 -9.0724772747343962e-01 +4.3977528592607662e-01 +2.6940460267990325e+00
0 +7.9275464521634946e+00 +7.9275464521634946e+00 +0.0000000000000000e+00
62 -1.8548596944797211e+01 -5.4790277060534924e+00 +2.6139138477487435e+01
6 +1.2924704321021094e+00 +1.6877384351121769e+00 +7.9053600602013496e-01
6 -3.3171488239787195e-01 +2.2533571426822441e-02 +7.0849690764938877e-01
42 -1.2244008274076272e+01 -4.3803622532274611e+00 +1.5727292041697622e+01
28 -6.4879408863560277e+00 -2.0449353257696048e+00 +8.8860111211728459e+00
15 -1.8286391324650033e+00 -1.5196311711353072e-01 +3.3533520307029452e+00
8 +2.1759449822523580e+00 +2.7580617137404237e+00 +1.1642334629761315e+00
22 -5.6711143175442951e+00 -2.5774433938755532e+00 +6.1873418473374837e+00
42 -1.2208204891217054e+01 -4.4330544820434756e+00 +1.5550300818347157e+01
13 -3.1256829511200452e+00 -1.6594343620519800e+00 +2.9324971781361304e+00
38 -1.0836746869828559e+01 -4.0353661266097092e+00 +1.3602761486437700e+01
0 +4.1157508691498172e+00 +4.1157508691498172e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +1.7957613239309698e+00 +2.1439375857027034e+00 +6.9635252354346733e-01
0 +7.1278666291482331e+00 +7.1278666291482331e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.7269098400438114e+00 +6.7269098400438114e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -5.3121414006981960e+00 -2.2760746573539739e+00 +6.0721334866884442e+00
34 -9.7939420537699498e+00 -3.8355457359247027e+00 +1.1916792635690495e+01
16 -2.8146414707509892e+00 -9.4352169230500493e-01 +3.7422395568919686e+00
0 +5.3739985986073977e+00 +5.3739985986073977e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +3.3151171036241323e-02 +1.3430092455333753e+00 +2.6197161489942680e+00
29 -6.1629253730403848e+00 -1.5689335704613956e+00 +9.1879836051579780e+00
0 +5.1808699462263368e+00 +5.1808699462263368e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -7.9652070197993856e+00 -1.3678530683006456e+00 +1.3194707902997481e+01
0 +7.9894655263729337e+00 +7.9894655263729337e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.3079192109021784e+00 +4.3079192109021784e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.6994612424647855e+00 +1.8599910259954902e+00 +3.2105956706140937e-01
24 -2.6450207007250759e+00 +9.1649800665812986e-01 +7.1230374147664115e+00
0 +8.0672259476583825e+00 +8.0672259476583825e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.8390417433521931e+00 -2.2646355300429302e+00 +5.1488124266185258e+00
27 -5.1478127821759161e+00 -9.3669756648219860e-01 +8.4222304313874350e+00
22 -5.3787640703873647e+00 -2.2452162421121695e+00 +6.2670956565503904e+00
19 -4.9270755163282365e+00 -2.4412468788978718e+00 +4.9716572748607293e+00
11 -7.5527317156551721e-01 +3.2127800481695656e-01 +2.1531023527649475e+00
34 -9.7326861951909294e+00 -3.8641865483402396e+00 +1.1736999293701381e+01
7 +3.4370573534335236e-01 +8.4636110915148688e-01 +1.0053107476162690e+00
0 +9.1579976867035899e+00 +9.1579976867035899e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.0657548474270859e+00 -1.4366903896290659e+00 +3.2581289155960400e+00
6 +1.4905869393791882e+00 +1.8569364671224129e+00 +7.3269905548644942e-01
20 -4.7533691964022049e+00 -2.0036888796606687e+00 +5.4993606334830725e+00
0 +6.5689001060417009e+00 +6.5689001060417009e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.2734369999567416e+00 +1.4669346328567707e+00 +3.8699526580005816e-01
18 -4.0665803987877025e+00 -1.8141574089470298e+00 +4.5048459796813454e+00
61 -1.8076896471452937e+01 -5.1584174413133841e+00 +2.5836958060279105e+01
34 -9.6680291278180128e+00 -3.8376039520678789e+00 +1.1660850351500269e+01
18 -4.5809910538677441e+00 -2.3142263856437451e+00 +4.5335293364479980e+00
27 -6.7832548405635267e+00 -2.5082145419282549e+00 +8.5500805972705436e+00
22 -5.0119420619250876e+00 -1.7943739736513118e+00 +6.4351361765475517e+00
22 -3.2503957148659017e+00 -1.2982166271303974e-01 +6.2411481043057240e+00
8 -1.1070152262223116e+00 -5.2758087763691019e-01 +1.1588686971708029e+00
19 -4.1556124181723293e+00 -1.6914792405456889e+00 +4.9282663552532808e+00
24 -3.2125967965563733e+00 +4.2958878203513473e-01 +7.2843711571830161e+00
12 +1.7479348257862339e+00 +3.0494592342751723e+00 +2.6030488169778767e+00
13 -1.7464695742935099e+00 -4.2532447970189047e-01 +2.6422901891832389e+00
7 +2.3582429646482161e+00 +2.8265516907486674e+00 +9.3661745220090253e-01
15 -2.0044696059294962e+00 -3.2647859457769624e-01 +3.3559820227035999e+00
7 +8.2574374593474431e-01 +1.3710672654391503e+00 +1.0906470390088119e+00
14 +1.0237012767835312e+00 +2.5175876783377173e+00 +2.9877728031083723e+00
17 -4.3156278747749353e+00 -2.2163625039747714e+00 +4.1985307416003277e+00
10 +7.2954086491251413e-01 +1.7126318556043429e+00 +1.9661819813836576e+00
3 +2.4794605190934327e-01 +3.5032392610235696e-01 +2.0475574838602739e-01
27 -5.8439244439448599e+00 -1.5663269898684513e+00 +8.5551949081528171e+00
40 -1.1137574562623151e+01 -3.7985169401689682e+00 +1.4678115244908366e+01
0 +1.6801496661963311e+00 +1.6801496661963311e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -4.0764962776957061e+00 +6.5996062886860485e-01 +9.4729138131286224e+00
3 +2.9226104656020002e-01 +3.8939698643363485e-01 +1.9427187974686966e-01
26 -6.2277459864408309e+00 -2.2026280312445961e+00 +8.0502359103924697e+00
0 +1.1342939137802377e+00 +1.1342939137802377e+00 +0.0000000000000000e+00
30 -8.1993469822978753e+00 -3.3742672105811482e+00 +9.6501595434334533e+00
0 +9.0090584866165457e+00 +9.0090584866165457e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.6562441384848610e+00 -1.8183343960361893e+00 +3.6758194848973433e+00
10 -1.2167250225388226e+00 -3.6750483443790927e-01 +1.6984403762018268e+00
15 -3.0373260153821251e+00 -1.2017779877030885e+00 +3.6710960553580732e+00
2 +1.9520515111644343e+00 +1.9879643434253693e+00 +7.1825664521870003e-02
31 -7.1493091456946916e+00 -2.0065701411713968e+00 +1.0285478009046589e+01
42 -9.2049064050707017e+00 -1.4293968878061625e+00 +1.5551019034529078e+01
12 +2.4414917210263187e-01 +1.4020320988817612e+00 +2.3157658535582586e+00
5 +6.1718466002105892e+00 +6.4018741186867789e+00 +4.6005503695237948e-01
8 -2.8612141808991876e-01 +3.5060421220967974e-01 +1.2734512605991970e+00
53 -1.5032064993529087e+01 -4.2749589087925584e+00 +2.1514212169473055e+01
24 -5.1380454661763215e+00 -1.6202186237961440e+00 +7.0356536847603550e+00
40 -1.0578205002273442e+01 -3.1864650212413466e+00 +1.4783479962064192e+01
31 -8.4348763406996348e+00 -3.2967025906724707e+00 +1.0276347500054328e+01
0 +9.2658454990768515e+00 +9.2658454990768515e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -4.0591027470576941e+00 -2.0909653492809666e+00 +3.9362747955534552e+00
26 -7.1628247002456389e+00 -3.1145345928769013e+00 +8.0965802147374752e+00
30 -6.7649698959370435e+00 -1.7527964090463710e+00 +1.0024346973781345e+01
0 +6.9793356884842312e+00 +6.9793356884842312e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +5.2590279943950158e-02 +2.0695440154537259e-01 +3.0872824320284487e-01
22 -5.6134096935082782e+00 -2.5620066965050325e+00 +6.1028059940064914e+00
18 -4.8436798128034768e+00 -2.4188041896939021e+00 +4.8497512462191494e+00
5 +3.6692259447302380e+00 +3.9898124612409527e+00 +6.4117303302142936e-01
14 -9.2775445294261250e-01 +7.2736839326578240e-01 +3.3102456924167898e+00
13 -2.3759622841755332e+00 -9.8643185945662593e-01 +2.7790608494378146e+00
0 +1.6241017795235603e+01 +1.6241017795235603e+01 +0.0000000000000000e+00
26 -5.9054016458285394e+00 -1.8224957472214405e+00 +8.1658117972141984e+00
23 -4.9984850461956443e+00 -1.6401497926451150e+00 +6.7166705071010586e+00
0 +7.5129226836896841e+00 +7.5129226836896841e+00 +0.0000000000000000e+00
22 -4.0102620370443836e+00 -8.5124871628832954e-01 +6.3180266415121080e+00
29 -8.1556119471608284e+00 -3.4055896739873353e+00 +9.5000445463469863e+00
0 +7.4471384811749388e+00 +7.4471384811749388e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +3.7761283620488113e+00 +3.7804031509156619e+00 +8.5495777337012413e-03
29 -5.7615216925516437e+00 -1.1357682726179801e+00 +9.2515068398673268e+00
45 -1.2061917076772463e+01 -3.4827073296334641e+00 +1.7158419494278000e+01
0 +5.3284238735247911e+00 +5.3284238735247911e+00 +0.0000000000000000e+00
10 +3.3192291931977902e-01 +1.2852145740725742e+00 +1.9065833095055904e+00
0 +2.4996874065825327e+00 +2.4996874065825327e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.9450472928655840e+00 -2.1465351568519151e+00 +5.5970242720273378e+00
0 +2.7701219329900315e+00 +2.7701219329900315e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.2341381742849604e+00 -1.0533077531759734e+00 +2.3616608422179741e+00
16 -3.9127706245585268e+00 -1.9813378714355832e+00 +3.8628655062458872e+00
69 -1.9652711829717820e+01 -4.6829290891921396e+00 +2.9939565481051361e+01
28 -7.0324577256860623e+00 -2.5805873988559989e+00 +8.9037406536601260e+00
7 -1.1158255412138685e+00 -6.3653884828805207e-01 +9.5857338585163276e-01
33 -8.2634626957095634e+00 -2.7085944458214541e+00 +1.1109736499776218e+01
41 -1.1721510833728555e+01 -4.1093745741633132e+00 +1.5224272519130484e+01
0 +1.0007869014722477e+01 +1.0007869014722477e+01 +0.0000000000000000e+00
4 +6.8136519632789572e-01 +8.3643803187000731e-01 +3.1014567108422320e-01
13 -3.0187469039146810e+00 -1.6153864694128557e+00 +2.8067208690036507e+00
17 -1.7198409931299148e+00 +4.1263233213331674e-01 +4.2649466505264630e+00
15 -2.8667337454370747e+00 -1.0310576470429731e+00 +3.6713521967882032e+00
1 +2.4793107538627832e+00 +2.4869702474642565e+00 +1.5318987202946666e-02
0 +4.9848524461151200e+00 +4.9848524461151200e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +8.6340637859483405e-01 +9.4938918771875969e-01 +1.7196561824785128e-01
9 +1.0088086734285380e+00 +1.8105889189874613e+00 +1.6035604911178467e+00
27 -6.8253597983466650e+00 -2.6705523863977838e+00 +8.3096148238977623e+00
34 -9.7430834866278992e+00 -3.7863788613151006e+00 +1.1913409250625598e+01
22 -5.1280555966902570e+00 -1.9587816934709794e+00 +6.3385478064385552e+00
7 +1.7954159717864364e+00 +2.2745794362642568e+00 +9.5832692895564087e-01
10 -1.1682525912736983e+00 -2.5065266974520473e-01 +1.8351998430569871e+00
0 +1.1275821204011102e+01 +1.1275821204011102e+01 +0.0000000000000000e+00
1 +3.4162830850641424e+00 +3.4422955902299632e+00 +5.2025010331641752e-02
39 -1.1148521158324918e+01 -3.9515776977605293e+00 +1.4393886921128779e+01
17 -2.5497713556778097e+00 -4.3750478616843358e-01 +4.2245331390187522e+00
55 -1.3819578245377873e+01 -2.4803596210012921e+00 +2.2678437248753163e+01
7 +1.4870220503102693e-01 +6.6439471312166587e-01 +1.0313850161812779e+00
11 -2.3487552775200973e+00 -1.2626544851946759e+00 +2.1722015846508427e+00
33 -7.8986174668557281e+00 -2.3538676267178493e+00 +1.1089499680275757e+01
20 -3.2487275788509615e+00 -5.4585076501833285e-01 +5.4057536276652574e+00
4 +2.7882644524423990e+00 +2.9497785280189301e+00 +3.2302815115306238e-01
0 +8.4524569341844344e+00 +8.4524569341844344e+00 +0.0000000000000000e+00
55 -1.5677974319694485e+01 -4.4387599757307665e+00 +2.2478428687927437e+01
1 +1.2299587398011536e+00 +1.2448423653443985e+00 +2.9767251086489921e-02
6 +4.6252911738378177e-01 +8.7150350612650707e-01 +8.1794877748545058e-01
11 +1.5052578528775218e-01 +1.2030554034542584e+00 +2.1050592363330125e+00
0 +7.9055673277112364e+00 +7.9055673277112364e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.4625969166988799e+00 +4.4625969166988799e+00 +0.0000000000000000e+00
9 -3.5628757725817106e-01 +3.7299913719868716e-01 +1.4585734289137164e+00
5 +7.0833941196300465e-01 +1.0014937665183670e+00 +5.8630870911072464e-01
32 -8.8125408113839896e+00 -3.3325978358297839e+00 +1.0959885951108411e+01
0 +8.1166284126396988e+00 +8.1166284126396988e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.6651103224714943e+00 -1.9467911350686076e+00 +3.4366383748057734e+00
77 -2.0393514919465492e+01 -3.1058885728048145e+00 +3.4575252693321353e+01
48 -1.2975259606282595e+01 -3.6367187058702291e+00 +1.8677081800824730e+01
0 +4.5621895623296069e+00 +4.5621895623296069e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -8.7337191344402409e-01 +1.3674112036559589e+00 +4.4815662341999660e+00
19 -1.2605111160444862e+00 +1.1731289295119289e+00 +4.8672800911128302e+00
4 +9.3230907582650957e-01 +1.0795675423468545e+00 +2.9451693304068982e-01
14 +4.7498685166481547e-01 +2.0186921699222160e+00 +3.0874106365148011e+00
1 +2.8670817192324880e+00 +2.8824565894504848e+00 +3.0749740435993544e-02
28 -6.4898561678369591e+00 -2.0718762408897864e+00 +8.8359598538943445e+00
9 -1.5320222006080035e+00 -7.3176600077733500e-01 +1.6005123996613371e+00
33 -8.9104446139074511e+00 -3.3147540915440823e+00 +1.1191381044726738e+01
11 -2.3775640650937069e+00 -1.3330856987146316e+00 +2.0889567327581506e+00
0 +3.9394490545475542e+00 +3.9394490545475542e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.6931534148690481e+00 +3.6931534148690481e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.5491982020235620e+00 +4.5491982020235620e+00 +0.0000000000000000e+00
11 +5.8277351207702299e-01 +1.6211837947625440e+00 +2.0768205653710421e+00
19 -5.1166680947638943e+00 -2.5067593009437448e+00 +5.2198175876402990e+00
13 -1.5936332973412881e+00 -1.9818304528242958e-01 +2.7909005041177171e+00
8 +2.0192657550744171e+00 +2.6952209503824927e+00 +1.3519103906161511e+00
9 -1.6333214106416500e+00 -9.1645142170341565e-01 +1.4337399778764688e+00
0 +7.1992414857340439e+00 +7.1992414857340439e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -1.1930407577843162e+01 -4.0251564655581031e+00 +1.5810502224570119e+01
18 -1.6980743004296910e+00 +5.5729839541882553e-01 +4.5107453916970330e+00
9 -1.4153675369098666e+00 -7.0744727248410744e-01 +1.4158405288515183e+00
34 -5.8119153930634555e+00 -9.4659302805575329e-03 +1.1604898925565795e+01
12 -9.0976401549334973e-01 +2.5610132737942104e-01 +2.3317306857455415e+00
0 +5.0462662963898470e+00 +5.0462662963898470e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.7692016395967274e+00 +1.8911374156083123e+00 +2.4387155202316979e-01
23 -4.8758885993192704e+00 -1.4702092341145985e+00 +6.8113587304093439e+00
49 -1.2756810811704316e+01 -3.0498342580905136e+00 +1.9413953107227606e+01
9 -1.5125087091571059e+00 -6.8656518118429410e-01 +1.6518870559456236e+00
0 +2.5028101683220534e+00 +2.5028101683220534e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.9613318318116422e+00 +3.9613318318116422e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +9.0626411865879053e-01 +1.2721672233011105e+00 +7.3180620928464002e-01
7 +4.5032793092458956e-01 +9.2994774373998546e-01 +9.5923962563079179e-01
13 -7.4274881867796072e-01 +7.0113257966750231e-01 +2.8877627966909261e+00
3 +1.9618010349570003e+00 +2.1044613307896056e+00 +2.8532059166521062e-01
20 -4.4984236817792231e+00 -1.8438603504415574e+00 +5.3091266626753315e+00
3 +2.8111152000224466e+00 +2.8954942809569681e+00 +1.6875816186904302e-01
48 -1.2875339594053603e+01 -3.5550369237153721e+00 +1.8640605340676462e+01
31 -7.4475551488201619e+00 -2.2297698528057626e+00 +1.0435570592028800e+01
0 +1.0708802339044675e+01 +1.0708802339044675e+01 +0.0000000000000000e+00
49 -1.4164639409523019e+01 -4.4742299910288761e+00 +1.9380818836988286e+01
13 -2.5531096090225978e+00 -1.1866818013306548e+00 +2.7328556153838859e+00
9 +1.5400485935467314e+00 +2.2917983987788180e+00 +1.5034996104641731e+00
4 +1.3038704485087891e+00 +1.5218566985537603e+00 +4.3597250008994237e-01
34 -8.9826033956487912e+00 -3.0569908395085039e+00 +1.1851225112280574e+01
12 -1.4555302171686941e+00 -2.1839859617160506e-01 +2.4742632419941781e+00
3 +5.3383730212605212e+00 +5.4188914827957753e+00 +1.6103692307050821e-01
10 +1.5668113713457634e+00 +2.5235708407496764e+00 +1.9135189388078260e+00
0 +5.2449981298897388e+00 +5.2449981298897388e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.8951089505432597e+00 -2.4251723613561853e+00 +4.9398731783741487e+00
40 -1.1170095667779687e+01 -3.7859092424088021e+00 +1.4768372850741770e+01
10 -1.1818172368565500e+00 -3.1347516937784192e-01 +1.7366841349574162e+00
22 -5.9918726498352681e+00 -2.8144751612294137e+00 +6.3547949772117089e+00
8 +2.0629095399415140e+00 +2.6978767058635240e+00 +1.2699343318440199e+00
36 -6.9518706921337872e+00 -6.9350647247026376e-01 +1.2516728439327046e+01
14 -2.8497547800503940e+00 -1.2822766202913853e+00 +3.1349563195180172e+00
19 -4.1244700819884494e+00 -1.6564447189872120e+00 +4.9360507260024749e+00
55 -1.6463282118774575e+01 -5.1920760335504372e+00 +2.2542412170448276e+01
1 +1.2728307354678590e+00 +1.2789540196404552e+00 +1.2246568345192443e-02
20 -2.4725023009738516e+00 +2.5798031758286966e-01 +5.4609652371134425e+00
0 +4.2330275850623700e+00 +4.2330275850623700e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.8825769469412181e+00 -2.0333929371194137e+00 +3.6983680196436088e+00
37 -9.0014580857139990e+00 -2.3399465560015891e+00 +1.3323023059424820e+01
13 -3.8667810212958020e-01 +1.0043879732262222e+00 +2.7821321507116048e+00
45 -1.2551055474937836e+01 -4.0438596623218919e+00 +1.7014391625231887e+01
10 +9.4798113162245823e-01 +1.8963204920505141e+00 +1.8966787208561118e+00
17 -2.9633092323309009e+00 -8.1487551247154233e-01 +4.2968674397187172e+00
0 +4.0533995745132003e+00 +4.0533995745132003e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.3118072806006193e+01 -4.4089087019694277e+00 +1.7418328208073532e+01
5 +5.1732695557213670e-01 +7.8804542504946706e-01 +5.4143693895466072e-01
3 +2.4818583856696179e+00 +2.6129538994540908e+00 +2.6219102756894586e-01
23 -5.9984094318614423e+00 -2.5973860399836113e+00 +6.8020467837556620e+00
2 +4.3364707057325775e+00 +4.3680586328552291e+00 +6.3175854245303142e-02
12 -2.4576076429031319e+00 -1.1558287557772848e+00 +2.6035577742516942e+00
23 -5.8632830408067056e+00 -2.5549390285986595e+00 +6.6166880244160922e+00
30 -4.8716448832339365e+00 +1.4794362713594067e-01 +1.0039177020739753e+01
31 -8.4455896345651595e+00 -3.3178818893509838e+00 +1.0255415490428351e+01
18 -4.5795898366986076e-01 +1.8264906026284233e+00 +4.5688991725965682e+00
10 -4.1123087580960682e-01 +5.0366979062909634e-01 +1.8298013328774063e+00
0 +4.4769168636936856e+00 +4.4769168636936856e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.2090521365110236e+00 -9.4928583424014512e-01 +2.5195326045417570e+00
4 +2.7316384922041603e-01 +4.6856027819493118e-01 +3.9079285794903029e-01
0 +2.8588048411063118e+00 +2.8588048411063118e+00 +0.0000000000000000e+00
30 -8.1081010337657915e+00 -3.2549629712393071e+00 +9.7062761250529697e+00
23 -5.8466112434689714e+00 -2.5444395796438597e+00 +6.6043433276502235e+00
11 -1.9074569553872296e+00 -8.4853114360419735e-01 +2.1178516235660645e+00
2 +2.5481638124093609e+00 +2.5921134424736243e+00 +8.7899260128526890e-02
0 +1.8347225884673710e+00 +1.8347225884673710e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.6966773592481159e+00 -2.3218252004368392e+00 +4.7497043176225535e+00
20 -5.1716831697227859e+00 -2.4718199859407233e+00 +5.3997263675641252e+00
11 -4.5146263037694911e-01 +6.5683852072683990e-01 +2.2166023022075780e+00
5 +3.9738041182832440e-01 +6.7980175085384253e-01 +5.6484267805103627e-01
7 +2.3101843179278339e+00 +2.8314991904429139e+00 +1.0426297450301600e+00
37 -1.0470852889196660e+01 -3.8919139448468973e+00 +1.3157877888699526e+01
35 -9.8562008017843326e+00 -3.6451417813865437e+00 +1.2422118040795578e+01
11 -1.6959910497990114e+00 -6.4551644323921931e-01 +2.1009492131195842e+00
0 +3.9318670709712862e+00 +3.9318670709712862e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -8.7930134648559388e-01 -4.2588998537352918e-01 +9.0682272222412941e-01
0 +2.7464274339743793e+00 +2.7464274339743793e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.8682938863855449e+00 -9.6016972687289570e-01 +1.8162483190252985e+00
31 -8.2037010285415946e+00 -2.9209054499151055e+00 +1.0565591157252978e+01
7 +1.4794671117221814e-01 +6.7182568747255411e-01 +1.0477579526006719e+00
57 -1.5629087008565456e+01 -3.8191939191253814e+00 +2.3619786178880148e+01
15 -3.4611223885142950e+00 -1.7340742577665931e+00 +3.4540962614954038e+00
0 +3.3084809975672820e+00 +3.3084809975672820e+00 +0.0000000000000000e+00
8 +9.1956112559947023e-01 +1.4970139489699039e+00 +1.1549056467408674e+00
4 +5.1875822961447966e+00 +5.3395367519763965e+00 +3.0390891166319989e-01
0 +5.2765435967210026e+00 +5.2765435967210026e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -3.2774349847268356e+00 -7.5684900695892843e-01 +5.0411719555358143e+00
14 +6.2770350795889751e-01 +2.1464524142509207e+00 +3.0374978125840464e+00
18 -4.0905794598725533e+00 -1.6764096042206686e+00 +4.8283397113037694e+00
4 +3.0452019387247526e+00 +3.2125296710162008e+00 +3.3465546458289630e-01
9 +1.6995950692755901e-01 +8.8303163846306809e-01 +1.4261442630710182e+00
9 -8.1948190423220790e-01 -6.0519699961781193e-02 +1.5179244085408534e+00
14 -1.7664465049220928e+00 -2.1373644873053577e-01 +3.1054201123831140e+00
14 -2.7922337397531907e+00 -1.1267147181393820e+00 +3.3310380432276174e+00
0 +5.8341128408280047e+00 +5.8341128408280047e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +3.4051697528497287e+00 +3.6209439704249360e+00 +4.3154843515041463e-01
26 -6.3917171694064328e+00 -2.3972711206538868e+00 +7.9888920975050919e+00
14 -2.6940646696950212e+00 -1.0970375935167680e+00 +3.1940541523565065e+00
39 -9.0702587091452926e+00 -2.0766193862730531e+00 +1.3987278645744478e+01
26 -7.1398515612173670e+00 -3.0731359949407500e+00 +8.1334311325532340e+00
23 -2.1435919336171709e+00 +1.2139630014108649e+00 +6.7151098700560716e+00
14 +8.3152494872247207e-01 +2.4648694384051333e+00 +3.2666889793653224e+00
50 -1.4701505945631791e+01 -4.8796170984445908e+00 +1.9643777694374400e+01
41 -1.2102583645907476e+01 -4.4263361316449661e+00 +1.5352495028525020e+01
1 +4.4064367281955654e+00 +4.4265103979095866e+00 +4.0147339428042272e-02
0 +8.9867244062009135e+00 +8.9867244062009135e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1027765024735636e+00 +8.1027765024735636e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.0334733575645906e+01 +1.0334733575645906e+01 +0.0000000000000000e+00
9 +1.5417461744618777e-02 +7.1634615143164826e-01 +1.4018573793740590e+00
15 -1.7377667294122556e-01 +1.5951831426700234e+00 +3.5379196312224979e+00
14 -3.4935448623071332e+00 -1.8572495066751711e+00 +3.2725907112639243e+00
16 -4.0721389381915367e+00 -2.1110238546278213e+00 +3.9222301671274309e+00
38 -8.1108211245507214e+00 -1.1752961673168221e+00 +1.3871049914467799e+01
0 +1.0145952104298148e+00 +1.0145952104298148e+00 +0.0000000000000000e+00
15 +3.7296058896302497e-02 +1.7191107454021650e+00 +3.3636293730117250e+00
16 +1.2587265561794858e-01 +2.0461160029146055e+00 +3.8404866945933138e+00
6 +1.4584232503986314e+00 +1.8772178008406639e+00 +8.3758910088406502e-01
16 -1.9724023820268881e+00 +1.5058630469395595e-03 +3.9478164901476553e+00
75 -2.1970948717560454e+01 -5.2235924879961635e+00 +3.3494712459128579e+01
4 +3.3528036279144358e+00 +3.5453306702156042e+00 +3.8505408460233692e-01
0 +4.1947518312403842e+00 +4.1947518312403842e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +3.3274375054704439e+00 +3.4833265440782606e+00 +3.1177807721563333e-01
15 -3.3528302154803145e+00 -1.6370310106515595e+00 +3.4315984096575098e+00
20 -1.5350500309971089e+00 +1.2690019362884244e+00 +5.6081039345710666e+00
24 -5.3283640584812213e+00 -1.8428002128399261e+00 +6.9711276912825904e+00
1 +2.7776283050326236e+00 +2.7912094292476399e+00 +2.7162248430032676e-02
0 +5.9344313541188773e+00 +5.9344313541188773e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +3.9631879574931430e+00 +4.0089978511033584e+00 +9.1619787220430737e-02
12 -2.5657256696112185e-02 +1.1720637785170673e+00 +2.3954420704263590e+00
0 +4.9903813675725637e+00 +4.9903813675725637e+00 +0.0000000000000000e+00
13 +5.9616777216159278e-01 +2.0340647429909700e+00 +2.8757939416587543e+00
36 -9.5587490489113129e+00 -3.0928777854114502e+00 +1.2931742526999725e+01
12 -1.7914604834601162e+00 -5.6620970928722603e-01 +2.4505015483457804e+00
0 +3.0418336721740031e+00 +3.0418336721740031e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -4.2016862518572156e+00 -1.3435467746032597e+00 +5.7162789545079118e+00
37 -1.0631362920761756e+01 -4.0035099648952439e+00 +1.3255705911733024e+01
32 -7.4275908750221289e+00 -1.9586532657080042e+00 +1.0937875218628250e+01
17 -2.2121019431336508e+00 -1.7040655021206952e-01 +4.0833907858431626e+00
2 +4.6946832728637471e+00 +4.7672367142483036e+00 +1.4510688276911310e-01
6 +1.2708017153601325e-01 +5.4859815559424163e-01 +8.4303596811645676e-01
45 -1.3236581271723416e+01 -4.6444173734504135e+00 +1.7184327796546008e+01
26 -5.8537713333596679e+00 -1.7716585364848660e+00 +8.1642255937496042e+00
0 +8.2865561409936923e+00 +8.2865561409936923e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +2.0152656389704049e-01 +1.0077336318612446e+00 +1.6124141359284083e+00
0 +9.1576384494036489e+00 +9.1576384494036489e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +5.2778613879446734e+00 +5.2778613879446734e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.3865080038918318e+00 +8.3865080038918318e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -7.0672614869466939e+00 -1.0011053197755144e+00 +1.2132312334342359e+01
25 -6.9624862915677950e+00 -3.1296001040911823e+00 +7.6657723749532254e+00
5 +2.6147451142575404e+00 +2.9372776023019069e+00 +6.4506497608873303e-01
44 -1.2888558679393984e+01 -4.4481717246469454e+00 +1.6880773909494078e+01
1 +5.3557108601699746e+00 +5.3772882296900200e+00 +4.3154739040090817e-02
17 -3.6285463811251004e+00 -1.4178465905368522e+00 +4.4213995811764963e+00
7 -1.1883726335087914e+00 -6.4167067530370847e-01 +1.0934039164101659e+00
27 -7.4739725004672222e+00 -3.1870339232902163e+00 +8.5738771543540118e+00
6 +1.5713776267190322e+00 +2.0062241064083048e+00 +8.6969295937854518e-01
0 +8.6577822294156483e+00 +8.6577822294156483e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.6725846685316412e+00 +8.6725846685316412e+00 +0.0000000000000000e+00
26 -5.9674837172270179e+00 -1.9368638978932713e+00 +8.0612396386674927e+00
25 -6.3627600182765081e+00 -2.5799923549040762e+00 +7.5655353267448637e+00
0 +7.2918495751543810e+00 +7.2918495751543810e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -5.5082657596758429e+00 -1.1648727789715818e-01 +1.0783556963557370e+01
1 +1.7408939937605199e+00 +1.7549359661301880e+00 +2.8083944739336175e-02
8 -2.2446545676376051e-01 +3.7489598199102403e-01 +1.1987228775095691e+00
6 -1.3059013430527955e-01 +2.0438462535739443e-01 +6.6994951932534796e-01
23 -6.0563411619124254e+00 -2.7851944537816786e+00 +6.5422934162614936e+00
36 -8.9394781405974193e+00 -2.4854484687856662e+00 +1.2908059343623506e+01
14 -2.0532390012168067e+00 -4.3440336103975064e-01 +3.2376712803541121e+00
18 -9.7040125859675630e-01 +1.4318015596466713e+00 +4.8044056364868553e+00
0 +5.9348068771093008e+00 +5.9348068771093008e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +2.4860399108909323e+00 +2.6251051837486195e+00 +2.7813054571537421e-01
10 -1.9425517685685874e+00 -1.0979129762713891e+00 +1.6892775845943966e+00
17 -3.1735710466741134e+00 -9.9668536490597504e-01 +4.3537713635362767e+00
0 +2.9729277372457172e+00 +2.9729277372457172e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.1224137121932136e+00 +2.1224137121932136e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.4432705103974959e+00 -7.5556252027973514e-01 +1.3754159802355215e+00
0 +2.8198225754205208e+00 +2.8198225754205208e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +3.0766280495424301e+00 +3.1183290827821004e+00 +8.3402066479340675e-02
21 -2.2283188514561738e+00 +6.5873312358973912e-01 +5.7741039500918259e+00
32 -8.8805829705582653e+00 -3.3863055968243243e+00 +1.0988554747467882e+01
15 -3.7462416183166267e+00 -1.9087095261159548e+00 +3.6750641844013439e+00
4 -1.7853472506826851e-01 +3.1203571035507416e-02 +4.1947659220755185e-01
0 +6.9307126172558204e+00 +6.9307126172558204e+00 +0.0000000000000000e+00
28 -7.3114158111792440e+00 -2.8476763769064708e+00 +8.9274788685455455e+00
11 -8.6342060912508778e-01 +2.8160750764090769e-01 +2.2900562335319909e+00
46 -1.3384944791846340e+01 -4.4353212974066611e+00 +1.7899246988879359e+01
7 -1.2616484436311781e+00 -7.2423128779810408e-01 +1.0748343116661481e+00
61 -1.7493163904079847e+01 -4.6269234802714037e+00 +2.5732480847616884e+01
7 +1.1904908785758410e+00 +1.6608499663320977e+00 +9.4071817551251335e-01
7 -3.9049920888070755e-01 +9.0015236075583260e-02 +9.6102888991258162e-01
11 -1.9069179199785404e+00 -7.7011577082356375e-01 +2.2736042983099534e+00
6 -8.2338871425090865e-01 -4.3712582532323374e-01 +7.7252577785534982e-01
0 +7.8192280646783905e+00 +7.8192280646783905e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.4166833887066907e-01 +1.9696455478420720e+00 +4.4226277734254822e+00
32 -8.2080590633586148e+00 -2.7580862527835661e+00 +1.0899945621150097e+01
11 -2.4366851116728760e-02 +1.0935916080582508e+00 +2.2359169183499592e+00
66 -1.8010334599378030e+01 -3.7565661757878255e+00 +2.8507536847180411e+01
6 -6.6511707301931899e-01 -2.6258595298839094e-01 +8.0506224006185612e-01
6 +1.9981054245794079e+00 +2.4319433865067794e+00 +8.6767592385474313e-01
1 +2.0177973655086952e+00 +2.0181000133975653e+00 +6.0529577774026677e-04
0 +3.8125352574492908e+00 +3.8125352574492908e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -2.7420984139514735e+00 -2.1820206047519530e-01 +5.0477927069525563e+00
6 +1.6302054158183008e+00 +2.0140500296027621e+00 +7.6768922756892266e-01
16 -3.0086630429773580e+00 -1.0105208340296499e+00 +3.9962844178954162e+00
11 -8.3861797313990571e-01 +2.0335173413878582e-01 +2.0839394145573831e+00
0 +8.0197274799324862e+00 +8.0197274799324862e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.1520147818649904e+00 +3.1520147818649904e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -8.0414325899149333e+00 -2.5705320464494061e+00 +1.0941801086931054e+01
9 +8.0099200560498218e-01 +1.6002258558789277e+00 +1.5984677005478911e+00
9 -3.9606562041174342e-01 +3.1651741928229482e-01 +1.4251660793880765e+00
10 -6.7692521114504522e-01 +1.7556501308430139e-01 +1.7049804484586932e+00
22 -5.5139782619688686e+00 -2.2674717766008623e+00 +6.4930129707360127e+00
14 -2.7293657983873212e+00 -1.1787781960535493e+00 +3.1011752046675438e+00
0 +8.5265069572592136e+00 +8.5265069572592136e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -8.0081462664197538e+00 -3.2721545100397957e+00 +9.4719835127599161e+00
48 -1.4094738123217585e+01 -4.6440837967052300e+00 +1.8901308653024710e+01
18 -4.1846417793538437e+00 -1.8571022664693730e+00 +4.6550790257689414e+00
1 +3.1495071189803574e+00 +3.1633321859537635e+00 +2.7650133946812261e-02
2 +2.0947911550302099e+00 +2.1462791899287694e+00 +1.0297606979711915e-01
23 -5.2744851089004774e+00 -1.8031782185381178e+00 +6.9426137807247192e+00
37 -9.0198324808299155e+00 -2.3187018023130550e+00 +1.3402261357033721e+01
8 -9.1421064334631108e-01 -2.2300249667163996e-01 +1.3824162933493422e+00
0 +9.0032587352088651e+00 +9.0032587352088651e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.8729372725225817e+00 -2.0300046009165462e+00 +3.6858653432120709e+00
17 -1.4379735105542659e+00 +7.1057672731649113e-01 +4.2971004757415141e+00
13 +2.4689600782300136e-01 +1.6068071460405191e+00 +2.7198222764350355e+00
9 +7.4490871018882387e-01 +1.4627431437022280e+00 +1.4356688670268083e+00
0 +4.0530693702658365e+00 +4.0530693702658365e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +4.5037872921976803e+00 +4.5478622009225571e+00 +8.8149817449753698e-02
1 +4.7273723360456783e+00 +4.7350883615608428e+00 +1.5432051030328964e-02
0 +7.9625994227257877e+00 +7.9625994227257877e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -1.7313232734467148e+00 -5.9405060743906368e-01 +2.2745453320153022e+00
43 -1.0299574469612846e+01 -2.2203553868333179e+00 +1.6158438165559055e+01
0 +9.6571174727155196e+00 +9.6571174727155196e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.7728727415970971e+00 +1.9714518344807979e+00 +3.9715818576740158e-01
4 +1.1842111073876183e+00 +1.3644682488910296e+00 +3.6051428300682264e-01
22 -5.0307987589875180e+00 -1.8599746590858324e+00 +6.3416481998033714e+00
20 -5.3686776668076037e+00 -2.5455333979853401e+00 +5.6462885376445273e+00
2 +1.5502702192664524e+00 +1.6202637532078579e+00 +1.3998706788281101e-01
0 +1.0642236980111829e+01 +1.0642236980111829e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +3.4635440552935268e+00 +3.4635440552935268e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +4.1600976272565049e-01 +6.1782161027743232e-01 +4.0362369510356366e-01
5 +1.4947756755453714e+00 +1.7239131382137045e+00 +4.5827492533666625e-01
20 -5.2531426979210680e+00 -2.4843281450440426e+00 +5.5376291057540508e+00
1 +2.7272397826980281e+00 +2.7382466272906059e+00 +2.2013689185155449e-02
0 +6.0557890720014882e+00 +6.0557890720014882e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.6014922425727969e+00 -2.0384262959278696e+00 +5.1261318932898545e+00
20 -3.8057172786430309e+00 -1.1456446067909378e+00 +5.3201453437041861e+00
0 +1.8098891381812493e+01 +1.8098891381812493e+01 +0.0000000000000000e+00
10 -1.5625678895796176e+00 -6.0035333191620222e-01 +1.9244291153268307e+00
0 +9.0527305385293513e+00 +9.0527305385293513e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.6194567168035965e+00 +6.6194567168035965e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.2749736255292339e+00 -1.7482370469981441e+00 +3.0534731570621796e+00
0 +1.4240145332426010e+01 +1.4240145332426010e+01 +0.0000000000000000e+00
9 +4.4836560403905068e-01 +1.2085759993904110e+00 +1.5204207907027207e+00
10 +1.8490224308647703e+00 +2.7390945659647916e+00 +1.7801442702000427e+00
14 -2.5636633572948488e+00 -8.9892401962482049e-01 +3.3294786753400567e+00
3 +6.0329605355001448e-01 +6.8873674221134440e-01 +1.7088137732265984e-01
0 +7.2851955742482133e+00 +7.2851955742482133e+00 +0.0000000000000000e+00
27 -7.5073630636063440e+00 -3.2878159709477179e+00 +8.4390941853172521e+00
53 -1.5228802612857443e+01 -4.4989474502093705e+00 +2.1459710325296143e+01
60 -1.3857935431845679e+01 -1.2518816701888840e+00 +2.5212107523313591e+01
18 -2.4630868344486840e+00 -4.3782017887909142e-02 +4.8386096331215498e+00
16 -3.9533522246097368e+00 -2.0531090803237086e+00 +3.8004862885720563e+00
12 -1.6854276380018298e+00 -5.2967883625208056e-01 +2.3114976034994985e+00
1 +2.0542830848622540e+00 +2.0545836394336447e+00 +6.0110914278155292e-04
16 -3.7661841155831182e+00 -1.8710531079649426e+00 +3.7902620152363511e+00
7 -1.2117863548624426e+00 -6.9271643073303046e-01 +1.0381398482588242e+00
0 +5.5388459225445761e+00 +5.5388459225445761e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +2.2917700406133790e-01 +1.4614931198962697e+00 +2.4646322316698637e+00
9 -1.0420815290240784e+00 -2.3695263919708243e-01 +1.6102577796539919e+00
5 +2.4926751645930256e-01 +5.4622385712212385e-01 +5.9391268132564257e-01
7 +1.2642714155331563e+00 +1.7934697269694531e+00 +1.0583966228725936e+00
8 +1.8162962309760804e+00 +2.4094157896311215e+00 +1.1862391173100821e+00
2 +3.3935128712235656e+00 +3.4244026819989255e+00 +6.1779621550719810e-02
6 +2.6356776187010320e+00 +3.0401209464692878e+00 +8.0888665553651151e-01
42 -9.6635419467510566e+00 -1.8899486407670096e+00 +1.5547186611968094e+01
0 +1.7169166488344834e+00 +1.7169166488344834e+00 +0.0000000000000000e+00
40 -1.1503426074624933e+01 -4.2648499345908579e+00 +1.4477152280068150e+01
15 -2.7783214809643697e+00 -9.2806121524981267e-01 +3.7005205314291141e+00
32 -8.4119278030289450e+00 -3.0801246735572709e+00 +1.0663606258943348e+01
14 -2.6741886531523500e+00 -1.1419938846427171e+00 +3.0643895370192658e+00
0 +3.0493441760089071e+00 +3.0493441760089071e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -3.4109693312401914e+00 -1.5577239598797785e+00 +3.7064907427208258e+00
23 -4.4102829262998133e+00 -1.0134617131576955e+00 +6.7936424262842356e+00
1 +3.6587034597741037e+00 +3.6602182485300427e+00 +3.0295775118780455e-03
53 -1.5795554820464250e+01 -5.1276481062857195e+00 +2.1335813428357064e+01
13 -2.8229514139038878e+00 -1.3707123122499030e+00 +2.9044782033079697e+00
6 +2.7320017725957011e+00 +3.1359563115599740e+00 +8.0790907792854583e-01
9 -5.9055297976596410e-01 +1.3092817989433625e-01 +1.4429623193206007e+00
64 -1.9272420747142046e+01 -5.6495962809714886e+00 +2.7245648932341116e+01
30 -8.3841162255011454e+00 -3.5115020957055525e+00 +9.7452282595911868e+00
0 +4.9303205511662309e+00 +4.9303205511662309e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +5.9126050576346678e-02 +1.9441512634600233e-01 +2.7057815153931131e-01
18 -4.5149886900451941e+00 -2.2431469725630535e+00 +4.5436834349642812e+00
13 -2.4245235653475161e+00 -1.0802754983647929e+00 +2.6884961339654465e+00
24 -5.0494570189109007e+00 -1.3910919097306973e+00 +7.3167302183604068e+00
33 -9.6262202004049975e+00 -3.8607104539457202e+00 +1.1531019492918555e+01
21 -3.4677272160704726e+00 -4.3960773606530834e-01 +6.0562389600103286e+00
16 -3.8515849453957189e+00 -1.8119831116421308e+00 +4.0792036675071763e+00
0 +1.0252618758200164e+01 +1.0252618758200164e+01 +0.0000000000000000e+00
12 +1.4804407258743879e-03 +1.2551046642096759e+00 +2.5072484469676031e+00
24 -5.6715151516408211e+00 -2.1391391038283860e+00 +7.0647520956248702e+00
3 +3.8670364180708550e-01 +5.2690401573018075e-01 +2.8040074784619051e-01
20 -2.2200711233512207e+00 +4.8436950249809474e-01 +5.4088812516986309e+00
8 +2.8659974302632536e+00 +3.5041714515695435e+00 +1.2763480426125797e+00
0 +7.5067424980768891e+00 +7.5067424980768891e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -4.4935825394848292e+00 -9.4564308501180117e-01 +7.0958789089460561e+00
0 +1.1852268060489816e+01 +1.1852268060489816e+01 +0.0000000000000000e+00
19 -4.2596617933111736e+00 -1.7929675919393584e+00 +4.9333884027436303e+00
24 -5.8103001097385638e+00 -2.2279979431750929e+00 +7.1646043331269418e+00
0 +3.7730692567231015e+00 +3.7730692567231015e+00 +0.0000000000000000e+00
34 -9.1660679809248045e+00 -3.1936543440271739e+00 +1.1944827273795262e+01
0 +7.6156312451773633e+00 +7.6156312451773633e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +7.7476584194816311e-01 +1.2804168532511366e+00 +1.0113020226059470e+00
66 -1.9193914029840947e+01 -5.0180103907784215e+00 +2.8351807278125051e+01
35 -9.1184981344779921e+00 -2.9995376309686153e+00 +1.2237921007018754e+01
10 -3.2543046460966707e-01 +5.4929847158594880e-01 +1.7494578723912317e+00
11 -1.4883095690307950e+00 -4.0240550361000782e-01 +2.1718081308415744e+00
4 +3.3838059368968976e+00 +3.6079446997598983e+00 +4.4827752572600144e-01
2 +2.4166737792546176e+00 +2.4478668159908925e+00 +6.2386073472549874e-02
21 -4.5505383385876561e+00 -1.6890358644772241e+00 +5.7230049482208640e+00
4 +1.3219407407318320e+00 +1.5388226830810616e+00 +4.3376388469845928e-01
23 -6.1861280216256960e+00 -2.8871738216192373e+00 +6.5979084000129173e+00
16 -4.0919813324748526e+00 -2.0576574102701040e+00 +4.0686478444094973e+00
6 +2.1510897595973923e+00 +2.5256057859288292e+00 +7.4903205266287376e-01
57 -1.5785255071167224e+01 -3.9331900434010856e+00 +2.3704130055532278e+01
2 +5.9283661405512635e+00 +5.9622026717169057e+00 +6.7673062331284228e-02
12 -2.4556951400947202e-01 +1.0680445495211344e+00 +2.6272281270612128e+00
22 -5.6593660030440249e+00 -2.5101203540106987e+00 +6.2984912980666525e+00
25 -4.3050937447952853e+00 -5.3954016904012647e-01 +7.5311071515103176e+00
4 -2.4796385431868639e-01 -2.7671503265270125e-02 +4.4058470210683254e-01
36 -9.7914435537315327e+00 -3.4038736578864572e+00 +1.2775139791690151e+01
0 +4.1573956029153445e+00 +4.1573956029153445e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -9.0866362094901802e+00 -3.5528358593916689e+00 +1.1067600700197023e+01
12 -2.9247460876881624e+00 -1.6069265891571369e+00 +2.6356389970620508e+00
2 +2.4743389042754433e+00 +2.5409570503769761e+00 +1.3323629220306543e-01
0 +4.4165068661571478e+00 +4.4165068661571478e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -7.1926097785476601e+00 -1.4773200650468590e+00 +1.1430579427001602e+01
0 +8.5830464146819896e+00 +8.5830464146819896e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -6.7897005907472963e-01 -1.3863047059986489e-01 +1.0806791769497295e+00
18 -3.1527383894544796e+00 -8.1724021464175767e-01 +4.6709963496254439e+00
9 -1.2632044086920375e+00 -5.3811920339399322e-01 +1.4501704105960886e+00
7 -1.2920813296765070e+00 -7.4364282468401122e-01 +1.0968770099849916e+00
5 +1.7784632561064146e+00 +2.0943649018171886e+00 +6.3180329142154790e-01
34 -6.9825634408405017e+00 -1.1295644165890883e+00 +1.1705998048502828e+01
4 +2.7962281252140104e+00 +2.9401449110695155e+00 +2.8783357171101009e-01
13 -2.1350311339610046e+00 -7.5639032005264673e-01 +2.7572816278167158e+00
12 -2.8017280866488230e+00 -1.5582336142532869e+00 +2.4869889447910722e+00
29 -8.1029720743991405e+00 -3.3701699009386372e+00 +9.4656043469210065e+00
53 -1.2639692634556390e+01 -1.9278558330662245e+00 +2.1423673602980330e+01
13 -2.9519274153309043e+00 -1.6248246204261281e+00 +2.6542055898095525e+00
30 -5.4759760062346823e+00 -5.8318312048765142e-01 +9.7855857714940626e+00
27 -7.5659395749576310e+00 -3.3046098888655884e+00 +8.5226593721840853e+00
3 +1.0607688560987381e+00 +1.1632120042586500e+00 +2.0488629631982391e-01
35 -8.3255160437259228e+00 -2.2669109939663485e+00 +1.2117210099519149e+01
1 +1.0698250538038332e+00 +1.0740553956518770e+00 +8.4606836960876564e-03
12 -1.2903083462656237e+00 -2.7067517216144754e-02 +2.5264816580989580e+00
11 -1.9505350581411216e+00 -8.3689645621326569e-01 +2.2272772038557118e+00
5 +4.1152785929389157e+00 +4.4291705578995000e+00 +6.2778392992116849e-01
3 +1.8983482746089138e+00 +2.0261979849422005e+00 +2.5569942066657347e-01
32 -6.2153585498593289e+00 -7.3216012276457954e-01 +1.0966396854189499e+01
12 -1.5728538161995251e+00 -3.8209802044332042e-01 +2.3815115915124094e+00
56 -1.6895587981619226e+01 -5.3133396955300451e+00 +2.3164496572178361e+01
34 -9.6178072631869220e+00 -3.8482569331397216e+00 +1.1539100660094402e+01
24 -6.4587897582665983e+00 -2.9755974867823936e+00 +6.9663845429684095e+00
39 -1.0452278969794598e+01 -3.3283478061374123e+00 +1.4247862327314373e+01
32 -6.5337094352887961e+00 -1.1598815022864788e+00 +1.0747655866004635e+01
23 -4.5547492019749596e+00 -1.1561160795702836e+00 +6.7972662448093519e+00
49 -1.3067942742966004e+01 -3.4109731354977577e+00 +1.9313939214936493e+01
5 +2.1628880855462365e+00 +2.4208812668830455e+00 +5.1598636267361808e-01
15 -3.8263977977819925e+00 -1.9774429250217591e+00 +3.6979097455204668e+00

Читать далее Новая программа для анализа субструктуры популяции

SNPweights: использование модели калькулятора K16 для анализа главных компонентов происхождения

Ранее я уже отрапортовал о создании двух новых моделей для стандартного этно-популяционного калькулятора, в разработке которых использовались геномы людей, cамостоятельно указавшими свое происхождение (self-reported ancestry).
К сожалению, очень часто субъективная оценка собственного происхождения (указываемого респондентами в опросниках) недостаточно надежна для статистических методов анализа происхождения, поскольку некоторые люди либо сообщают ложные сведения о своей родословной или же просто не знают о своем истинном происхождении. Что еще хуже, — во многих публичных популяционных выборках мы не находим никаких  сведений о точном этническом составе людей в выборке . Как многие из вас знают,  существует множество способов достаточно точной оценки происхождения индивида на основе данных SNP генотипирования.

Самый простой способ сводится к следующему: сначала исследователь объединяет генотипы из своего исследования с генотипами образцов в референсной панели (например: HapMap или 1000 геномов),  затем находит пересечение SNP-ов в каждом наборе данных, а затем запускает программу кластеризации, чтобы увидеть, каким образом образцы исследования группируются с популяциями референсных панелей.  В принципе,  сам процесс несложный, но требует немало времени

К счастью, в 2014 году лабораторией Alkes была предложена программа которая, по сути, значительно облегчает процесс, выполняя большую часть работу за вас. Программа называется SNPWEIGHTS и можно скачать здесь.  Говоря простым языком, программа принимает  в качестве входных данных генотипы SNP-ов, самостоятельно находит пересечение генотипов SNP с генотипами в эталонной выборке , рассчитывает веса SNP-ов на основе предварительно настроенных параметров, чтобы построить первую пару главных компонентов (иначе говоря,  cобственных векторов), а затем вычисляет процентное значение происхождения индивидуума из каждой предковой популяции (кластера).

Для того, чтобы запустить программу, необходимо убедится в том, что в вашей системе установлен Python, и что ваши данные генотипирования приведены в формате EIGENSTRAT. Краткую инструкции по преобразованию в формат EIGENSTRAT с помощью инструмента convertf можно почитать здесь.  Данные аутосомного генотипирования FTDNA или 23andme можно напрямую преобразовать в формат EIGENSTRAT с помощью утилиты aconv от Феликса Чандракумара (либо любого самописного софта).

Затем необходимо загрузить сам пакет SNPWEIGHTS и референтную панель с весами снипов.

  • Панель весов SNP для популяций Европы и Западной Африки можно скачать здесь.
  • SNP веса для населения Европы, Западной Африки и  Восточной Азии можно скачать здесь.
  • SNP веса для населения Европы, Западной Африки, Восточной Азии и популяций американских индейцев можно скачать здесь.
  • SNP веса для популяций северо-западной, юго-восточной части Европы, ашкеназских евреев и можно скачать здесь.

Затем необходимо создать файл параметров par.SNPWEIGHTS с названиями входных файлов EIGENSTRAT, референтной панели, и файл c результатами. Например:

input_geno: data.geno
input_snp: data.snp
input_ind: data.ind
input_pop: CO
output: ancestry.txt

И, наконец, нужно запустиь программу с помощью команды inferancestry.py —par par.SNPWEIGHTS. Для того чтобы программа работала, убедитесь, что inferancestry.info и  файл референтной панели  находятся в том же каталоге, что и файл inferancestry.py.

Полученные результаты можно использовать для разных целей. Например,  можно сгенерировать два информативные графика.

Первый график — обычный график PCA c двумя первыми компонентами (собственными векторами) и наложенный на график процентный расклад компонентов происхождения:

Второй треугольный график, на каждом отрезке которого , представлен процентный вклад одной из трех исконных групп популяции (например: Европы, Африки и Азии, в случае с нашими данными этот пример можно заменить на европейских охотников-собирателей, земледельцев неолита и степных скотоводов эпохи бронзы).

Вот простой код генерирования этих графиков в R. В программе R нет базовых пакетов для построения триангулярных графиков, поэтому  нужно будет сначала установить пакет plotrix. Ancestry.txt  — это файл полученный на выходе из SNPWEIGHTS:

# EV Plot with Percent Ancestry Overlay
data=read.table("ancestry.txt", as.is=T, header=F)
names(data)
plot(data$EV1, data$EV2, pch=20, col="gray", xlab="EV1", ylab="EV2")
text(data$EV1, data$EV2,labels=round(data$EUR,2)100, cex=0.4, offset=0.1, pos=3)
text(data$EV1, data$EV2,labels=round(data$AFR,2)
100, cex=0.4, offset=0.1, pos=2)
text(data$EV1, data$EV2,labels=round(data$ASN,2)*100, cex=0.4, offset=0.1, pos=1)
#Triangle Plot
data$total=data$EUR+data$AFR+data$ASN # Need to account
data$European=data$EUR/data$total # for slight rounding
data$African=data$AFR/data$total # in the ancestry
data$Asian=data$ASN/data$total # estimation file for
data_p=data[c("European","Asian","African")] # triax.plot to work
library(plotrix)
triax.plot(data_p, pch=20, cc.axes=T, show.grid=T)

 

Разумеется, размещенные на сайте разработчика референтные панели носят ограниченный характер. Поэтому я решил заполнить пробелы, преобразовав аллельные частоты SNP-ов в 16 предковых компонентах в 16 синтетических «чистых» предковых популяций, каждая из которых состояла из 200 синтетических индивидов («симулянтов») состоящих на 100 процентов из одного компонента происхождения в модели K16). Файл с генотипами 3200 «симулянтов» я использовал для вычисления весов снипов в каждом компоненте. Продвинутые пользователи, желающие протестировать модель K16 до ее публичного релизма, могут скачать полученный файл с весами снипов  здесь, а затем, cледуя приведенным выше инструкциям, использовать его в качестве референтной панели (а затем сравнить свои результаты с усредненными результатами разных этнических популяций).

Я протестировал веса снипов в модели K16 (выражаю признательность автору программу Чену за помощь), и обнаружил, что между данными калькулятора и данными SNPWEIGHTS расхождения носят незначительный характер, хотя похоже, что SNPWEIGHTS не так сглаживает минорные компоненты происхождения (что позволяет легче выделить в пространстве главных компонент кластеры):

test (1)

Окончание процесса фазирования и импутирования геномов

К середине мая этого года я закончил трудоемкий процесс импутации сборной солянки из 9000 публично доступных образцовых представителей  700 различных человеческих популяций, генотипированных в разное время на разных снип-платформах (главным образом — Illumina и Affymetrix)
Строго говоря, я планировал завершить этот этап работы намного раньше, но в ходе выполнения работ возник ряд обстоятельств, помешавших завершить этот этап в срок. Главным из них является смена сервера где я выполнял импутирование геномов. Я начал работать на сервере Мичиганского университета, однако в ходе процесса перешел на аналогичный сервис Института Сэнгера (имени того самого нобелевского лауреата, предложившего первый метод полного сиквенирования генома).
Это решение было продиктовано необходимостью использовать новейшую референсную панель аутосомных гаплотипов — Haplotype Reference Consortium (в нее входит примерно 30 тысяч, а после предстоящего этим летом обновления — свыше 50 тысяч — аутосомных геномов, т.е свыше 60 тыс. гаплотипов). Надо сказать, этнический состав выборки референсных геномов впечатляет, хотя и там по-прежнему наблюдается перекос в сторону европейских популяций. К сожалению, и эта новейшая выборка представлена преимущественно европейцами (поэтому вероятность  импутированных генотипов для европейских популяций оказались лучше аналогичных результатов в африканской и азиатской когортах), однако даже с учетом этого обстоятельства ее надежность в определении негенотипированных аллелей снипов выше 1000 Genomes (не говоря уже о HapMap):

1 UK10K 3715 3781 6.5x
2 Sardinia 3445 3514 4x
3 IBD 4478 4478 4x + 2x
4 GoT2D 2710 2974 4x/Exome
5 BRIDGES 2487 4000 6-8x (12x)
6 1000 Genomes 2495 2535 4x/Exome
7 GoNL 748 748 12x
8 AMD 3305 3305 4x
9 HUNT 1023 1254 4x
10 SiSu + Kuusamo 1918 1918 4x
11 INGI-FVG 250 250 4-10x
12 INGI-Val Borbera 225 225 6x
13 MCTFR 1325 1339 10x
14 HELIC 247 2000 4x (1x)
15 ORCADES 398 399 4x
16 inCHIANTI 676 680 7x
17 GECCO 1131 3000 4-6x
18 GPC 697 768 30x
19 Project MinE — NL 935 1250 45x
20 NEPTUNE 403 403 4x
Totals 32611 38821
22 French-Canadian 2000 5-6X End 2014
23 Converge 12000 1x Now
24 UG2G Uganda 2000 4x 2015
25 Arab Genomes 100 30x
26 Ashkenazi 128 CG Now
27 INGI-Carlantino 94 4x Now
28 CPROBE 80 80 4x

 

Cледуя рекомендациям, я получил набор из 9000 образцов, каждый из которых включает в себя набор из 20-30 миллионов снипов. К сожалению, из-за субоптимальности результатов в некоторых выборках (Xing et al, Henn et al. и ряде других), их придется исключить из тех видов анализа, которые требует максимальной точности исходных данных. Импутированные генотипы (выраженные через оцененные вероятности) были трансформированы с помощью программы Plink 1.9 в генотипы, причем выбирались варианты полиморфизмов с вероятностью 0.8 (—hardcallthreshold 0.8)

Для оценки полезности импутированных генотипов для популяционного анализа я использовал метрику nearest в программе Plink (матрица с дистанцией между ближайшими геномами) и кластерограммы IBS (идентичности по генотипам).

Таблица метрики nearest (Z-статистика)

А это кластерограмма с хорошо видно географической локализацией кластеров. Я использовал для кластеризации матрицы IBS несколько разных алгоритмов — наиболее убедительный вариант был получен с помощью алгоритма Ward

Другие варианты топологии кластерограмм в формате NEWICK и TRE можно посмотреть здесь (их можно открыть в любой программе для визуализации филогенетических деревьев).

Таким образом, для некоторых типов анализа в популяционной генетике использование импутированных снипов может сослужить хорошую службу, смягчая (или, наоборот, увеличивая) градиент частот аллелей).

Дополнительные анализы — fastIBD, IBS, анализ главных компонентов — образцов в выборке, только подтверждает это наблюдение:


Но самое лучшее подтверждение надежности импутированных снипов для анализа компонентов происхождения  было получено с помощью p-теста Z-статистики во время оценки правильности определенной топологии дерева компонентов (с допущением фактора смешивания предковых компонентов). Для этой цели я использовал стандартный инструмент — программу TreeMix. Я использовал только те снипы, которые встречаются в моей контрольной выборке (референсов каждого из компонента) с частотой выше 99 процентов. Как видно из нижеприведенного графика, компоненты выбраны правильно, а топология определяется практически безошибочно, несмотря даже на малое количество снипов (6 тысяч). Правильно определились и направления потоков генов, дрейфов генов (указаны стрелками). Тут в принципе мало нового — большинство этих эпизодов уже были описаны в отдельных работах генетиков. Так, виден поток генов от «денисовского» человека к усть-ишимцу, от которого в свою очередь идет поток генов к австралоидным популяциями. То есть денисовская примесь у папуасов могла достаться от сибирских популяциях близких к «усть-ишимцу». Виден также вклад ANE/EHG в геном североамериканцев -в интервале 10-15 процентов.

Принципально новым является лишь определенный программой дрейф генов в направлении от африканцев Khoisan к североафриканцами (в качестве референса которых взяты египтяне, бедуины и алжирцы). Скорее всего, это и есть тот самый пресловутый сигнал «египтского выхода» человечества из Африки, о котором недавно писалось в новейшей статье, а сам компонент -идентичен пресловутому Basal-Eurasian component


В начале июля  в связи с публикацией препринта о генофонде древних ближневосточных земледельцев решился все таки подписать заявление на имя Давида Рейха и Иосифа Лазаридис с ходатайством о доступе к полной версии их выборки (она включает много новых интересных для меня популяций — например, около сотни новых образцов шотландцев, шетландцев, ирландцев из разных областей Ирландии, немцев, сорбов и поляков из восточной и западной Польши).

Г-н Лазаридис был весьма любезен и буквально на следующий день после получения подписанного заявления предоставил мне доступ к этим данным. Я займусь их плотным изучением чуть позже. А пока любопытно посмотреть результаты пилотного Admixture анализа 5900 публичных доступных образцов. В качестве проверки надежности своего нового метода изучения древних и современных популяций людей, я провел 4 параллельных анализа Admixture c разным дефолтным значением предковых популяций (K).

Разумеется, в нашем случае число компонентов K заведомо больше 3, авторы статьи эмпирически показали что меньший разброс значений был получен при K=11. Поэтому я исходил из этой цифры, назначив три разных значения K — 10,11,13.
В первом варианте я использовал т.н unsupervised режим Admixture, т.е. программа должна была сама угадать и реконструировать частоты аллелей снипов в 10 реконструируемых предковых «компонентах» популяций.

Как и ожидалась, таковыми оказались африканский (пик у пигмеев и бушменов), америндский (пик у эксимосов и американских индейцев), сибирский (пиковые значение у нганасанов), южно-индийский компонент (пик в народностях Paniya и Mala), австрало-меланизийский, южно-восточноазиатский, три западно-евразийских компонента — 2 компонента западноевроп ейских и кавказских охотников-собирателей и неолитический; и наконец ближневосточный.

Разумеется, за исключением трех компонентов с пиками в древних геномах, данное распределение отражает cовременное распределение предковых компонентов.

Пришлось вручную выделять из ближневосточного компонента популяцию базальных европейцев (в качестве основы я взял геномы натуфийцев, т.е ближневосточный компонент — Levant_N — может быть разложен на два отдельных предковых компонента — неолитический и мезолитический «натуфийский»), а затем сгенерировать гипотетическую популяцию из 20 образцов состоящих на 100 процентов из натуфийского компонента. Именно этот компонент был включен в модель K11 под названием Levant_Mesolithic ( или Natufian). Этот компонент не стоит путать с компонентом Basal-Eurasian в калькуляторе Eurogenes K7 Basal-rich, так в в моей модели K11 основная часть базального компонента ушла в неолитические компоненты (т.е Natufian=Basal-Rich — Neolithic)

Гораздо сложнее ситуация обстояла с разделением компонента кавказских охотников-собирателей, которые наряду с американскими аборигенами несут в своем геноме значительные доли компонента древних северо-евразийцев. По этому причине очень сложно, например, разделить восточных охотников-собирателей (из мезолитических культур Карелии и Самары) и синхронным им кавказских охотников-собирателей.
Из-за присутствия компонента древних северо-евразийцев в их геноме, в Admixture компонент древних кавказцев увеличивается только за счет компонент восточных охотников-собирателей — и наоборот. Правда, можно попытаться выделить отдельный мезолитический компонент населения горного Загроса (Иран).

В случае успеха древние геномы жителей мезолитической Грузии можно будет представить как 20% компонента степных охотников-собирателей + 80% местного мезолитического субстрата.

Две новые модели для калькулятора DIYDodecad

Закончил на 99% подготовку 2 моделей этно-популяционных калькуляторов ДНК — заточенную под deep ancestry (анализ современных геномов с использование древних геномов) K11 и модель для анализа популяционного происхождения современных популяций K16.

 

В число 16 «предполагаемых предковых» популяций в K16 входят следующие выделенные группы:

Австрало-веддоидная
Палеолитические охотники-собиратели Кавказа
Американские аборигены
Охотники-собиратели скандинавского мезолита
Австронезийцы
Ближневосточные неолитические земледельцы
Сибирские аборигены
Ближне-восточные популяции
Североафриканские популяции
Популяции западной Африки
Северные популяции Индостана
Юго-восточноазиатские популяции
Восточные охотники-собиратели
Неолитическое население Европы
Восточно-африканские популяции
Западноевропейские охотники-собиратели

 

Таблица FST между компонентами K11 (FST — Индекс фиксации Райта Fst, отражающий меру дифференциации популяций)

Кластеризация компонентов модели K11 по степени дифференциации

Таблица FST между компонентами K16

Кластеризация компонентов модели K16 по степени дифференциации

 

На следующем PCA графике отображены 2 группы компонентов — предковые компоненты K16 (полученные в программе ADMIXTURE в ходе анализа современных популяций) и предковые компоненты K11 (они вычислены в той же программе, но на другой выборке аутентичных палеогеномов). Поскольку у пользователей подобных калькуляторов часто возникает вопрос о соотношении компонентов разных моделей калькуляторов, я решил разместить их на одном графике. Методология довольно проста. Сначала я сгенерировал в программе PLINK 220 «синтетических» геномов (20 индивидов в 11 группах). В основу положен предложенный Понтикосом метод популяционных «zombies», в котором используется частоты аллелей снипов, полученных в программе ADMIXTURE. Каждая из 11 групп состоит из 20 «индивидов», геном которых на 100% состоит из одного компонента.
То же самое я сделал с компонентами K16. Затем в целях изучения соотношения компонентов этих двух разных моделей, я пропустил «геномы синтетических индивидов» K16 через калькулятор K11. В итоге выяснилось, что только несколько компонентов K16 полностью совпадают с компонентами K11 (например, Amerindian и African). Остальные компоненты K16 разложились на комбинации компонентов K11. Этот простой эксперимент еще раз подтвердил очевидный факт: предковые компоненты ADMIXTURE, выявленные в ходе анализа современных популяций только в редких случаях соответствуют настоящим предковым компонентам. Большинство подобных компонентов возникают в результате сложного процесса фиксации аллельных частот, например в тех случаях, когда непосредственно после смешивания предковых групп разного происхождения происходит процесс генетического дрейфа. Закон Харди—Вайнберга утверждает, что в теоретической идеальной популяции распределение генов будет оставаться постоянным из поколения в поколение. Так, в популяции растений количество «внуков» с генами высокорослости будет ровно таким же, сколько было родителей с этим геном. Но в реальных популяциях дело обстоит иначе. Из-за случайных событий частота распределения генов из поколения в поколение несколько варьирует — это явление называется дрейфом генов. Рассмотрим крупную размножающуюся популяцию со строго определенным распределением аллелей. Представим, что по той или иной причине часть этой популяции отделяется и начинает формировать собственное сообщество. Распределение генов в субпопуляции может быть нехарактерным для более широкой группы, но с этого момента и впредь в субпопуляции будет наблюдаться именно такое, нехарактерное для нее распределение. Это явление называется эффектом основателя.Дрейф генов сходного типа можно наблюдать и на примере явления с запоминающимся названием эффект бутылочного горлышка. Если по какой-либо причине численность популяции резко уменьшится — под воздействием сил, не связанных с естественным отбором (например, в случае необычной засухи или непродолжительного увеличения численности хищников), быстро появившихся и затем исчезнувших, — то результатом будет случайное устранение большого числа индивидуумов. Как и в случае эффекта основателя, к тому времени, когда популяция вновь будет переживать расцвет, в ней будут гены, характерные для случайно выживших индивидуумов, а вовсе не для исходной популяции.

PCA correlation between K11 and K16 components Вот эта таблица с усредненными значениями «симулянтов» компонентов K16 в калькуляторе K11 (колонки — компоненты K16, столбцы — компоненты K11, их пересечения — проекция компонентов K16 в компоненты K11).

Для облегчения понимания сказанного, приведу немного теории. Начну с основ.

Определение базовых терминов

ADMIXTURE (буквально: примесь) – это компьютерная программа (анализ), позволяющая выявлять смешанность состава некоего набора индивидов на основе данных о генотипах и тем самым строить предположения о происхождении популяции.

Принцип работы ADMIXTURE.

Рассмотрим принцип работы ADMIXTURE на примере образцов и популяций из проекта HapMap.

Всего у нас N = 324 образца/индивида, каждый из которых относится к одной из четырех нижеперечисленных популяций:

АФРИКА (ASW) – Африканские предки из Юго-Западной части США
ЮТА (CEU) – жители штата Юта США с корнями из Северной и Западной Европы
МЕКСИКА (MEX) – Мексиканцы, Лонг-Айленд США
ЙОРУБА (URI) – Йоруба, Нигерия
Для удобства дальнейшего изложения будем называть эти популяции «известными».

Также мы предполагаем, что они произошли от К разных предковых популяций (мы не знаем от каких именно). В дальнейшем будем называть эти предковые популяцие «предполагаемыми предковыми». Этих «предполагаемых предковых» популяций на самом деле не существует, у них нет общепризнанных названий и характеристик. И на этом этапе мы даже не знаем какие образцы к какой из этих К популяций могут быть отнесены. Теоретически возможно, что образцы из одной и той же «известной» популяции могут принадлежать к двум разным «предполагаемым предковым» популяциям.

Пример 1.

Предположим, что К = 3.

ADMIXTURE далее работает с образцами (их генотипами) и заданным нами числом К = 3. Имея сведения о генотипах и предположение о количестве «предполагаемых предковых» популяций (К) ADMIXTURE строит свою модель (предположение) того, каков вклад каждой из «предполагаемых предковых» популяций в каждый индивид. В результате мы имеем для каждого индивида 3 цифры: количественный вклад каждой из трех популяций (или образно говоря, на сколько процентов данный индивид состоит из первой «предполагаемой предковой» популяции, на сколько – из второй и на сколько – из третьей). При этом может быть и такая ситуация, что у конкретного индивида в составе отсутствует какая-то из «предполагаемых предковых» популяций, даже возможно, что он принадлежит только к одной из «предполагаемых предковых» поуляций. Предположим, для индивида №1 эти цифры такие: 0.3, 0.5 и 0.2. Что эти цифры означают? Означают они доли каждой из «предполагаемых предковых» популяций (ППП) в индивиде №1, т.е. индивид состоит на 30% из первой ППП, на 50% — из второй и 20% — из третьей. Чем больше вклад каждой ППП в индивида, тем больше индивид является «носителем» данной популяции и ее представителем.
Так называемый этно-популяционный калькулятор ДНК представляет собой инструмент, позволяющий использовать заранее определенные (вычисленные) компоненты этнического происхождения K для определения той комбинация исходных предковых компонентов дает наилучшее соответствие (аппроксимирует) происхождение носителя тестируемой ДНК.

При создании калькулятора ДНК в основу берется определенная модель (например, задается исходное число компонентов или состав референсной выборки), что неизбежно приводит к определенным уступкам в плане точности и проявлению слабых сторон модели. Например, часто люди критикуют подобные модели калькуляторов за излишнюю европоцентричность и недостаточную представленность геномов из других мест, или же используемые для определения компонентов происхождения выборки данных по отдельным популяциям слишком малы для определения сложной субструктуры генофонда референсной популяции. Наконец, более грамотные люди указывают на отсутствие необходимо инструментария (например, формальной статистики) для проверки статистической значимости определенных компонентов в отдельных моделях калькулятора.
Движок обеих калькуляторов — все та же программа DIYDodecad, После того, как ппрограммма ДНКа калькулятора выдаст первичные результаты — процентное распределение компонентов этно-популяционного происхождения в изучаемом геноме, можно будет перейти к вторичному анализу. Суть его проста — зная процентную комбинацию компонентов происхождения в своем геноме, довольно просто смоделировать свой геном в виде смеси нескольких референсных популяций.

Поэтому, в отличие от предыдущих релизов, K11 и K16 будут включать в себя дополнительный контент:

1) классический Oracle, позволяющий смоделировать анализируемый «геном» (точнее, набор из 100-200 тысяч информативный снипов) в виде комбинации двух референсных популяций, а также установить группу генетически ближайших референсных популяций к геному изучаемого индивида. Однако этот инструмент не может быть использован в случае сложного смешанного происхождения (например, когда изучаемый индивид происходит из более чем двух разных этнических популяций). Иногда программа выдает довольно глупые комбинации, cущественным образом понижая достоверность результатов. Впрочем основное преимущество Oracle и состоит в том, что программа предлагает вместо окончательного «простого» решения список альтернативных вариантов.

Пример: в качестве примера я буду использовать собственные данные.
Исходя из полученных в модели K16 значений компонентов, мой условный наиболее близок к восточнославянским популяциям
«Ukrainian-Center» «2.5884»
«Pole» «3.0962»
«Sorb» «3.1733»
«Polish_West» «3.5992»
«Russian-North-West» «3.7265»
«Russian_Smolensk» «3.834»
«Polish» «4.0348»
«Belarusian_EastBelarus» «4.0852»
«Belarusian_WestBelarus» «4.1216»
«DonKuban_cossack» «4.7769»

В комбинированном варианте двух смешанных популяций распределение предковых компонентов происхождения может быть аппроксимировано следующими комбинациями:

«65.8% Belarusian_EastBelarus + 34.2% Norwegian» «1.1023»
«66.4% Belarusian_EastBelarus + 33.6% Icelandic» «1.1118»
«80.9% Latvian + 19.1% Spanish_Baleares_IBS» «1.1154»
«30% French + 70% Lithuanian» «1.1206»
«29% French + 71% Latvian» «1.1215»
«55% French_West + 45% Lithuanian_Zemajitia» «1.1302»
«28.9% French_East + 71.1% Latvian» «1.1402»
«29% French_Northwest + 71% Latvian» «1.1563»
«72.3% Belarusian_EastBelarus + 27.7% Orcadian» «1.1766»
«57.2% European_Utah + 42.8% Lithuanian_Zemajitia» «1.1825»

Основная часть генома — условно славяно-балтийская (что ожидаемо), но с существенным сдвигом в сторону Скандинавии и западной Европы(примерно 20-30%). Скорее всего, это наследие готов, или контактов балтийских племен с викингами. Интересно, что модель K11 (c использованием современных референсных популяций) дает примерно такой же расклад — разве что древний скандинавско-германский пласт выражен чуть резче чем в модели K16

«Belarusian_West» «2.3841»
«Belarusian» «2.4187»
«Pole_Poland» «2.5278»
«Belarusian_East» «3.7288»
«Russian_Central» «3.7635»
«Swede» «3.9724»
«Russian_cossack» «4.1139»
«Ukrainian» «4.2647»
«Russian_Southern» «4.5204»
«Ukrainian_East» «4.8635»
«66.6% Icelandic + 33.4% Latvian» «1.586»
«41.1% Latvian + 58.9% Orcadian» «1.5898»
«47.9% Lithuanian + 52.1% Orcadian» «1.6007»
«60.2% Icelandic + 39.8% Lithuanian» «1.6082»
«5.7% Basque_Spanish + 94.3% Belarusian» «1.6386»
«5.8% Basque_French + 94.2% Belarusian» «1.6406»
«67.2% Belarusian + 32.8% Swede» «1.659»
«40.2% Lithuanian + 59.8% Norwegian» «1.6876»
«33.7% Latvian + 66.3% Norwegian» «1.689»
«94.1% Belarusian + 5.9% Spanish_Pais_Vasco_IBS» «1.7359

В палеокалькуляторе K11 (т.е. с древними геномами) картинка кажется более убедительной

«Unetice_EBA» «2.7065»
«Bell_Beaker_Czech» «5.0633»
«British_AngloSaxon» «5.1998»
«Nordic_LN» «5.6157»
«Corded_Ware_Proto_Unetice_Poland» «6.3751»
«Nordic_MN_B» «6.3865»
«Halberstadt_LBA» «6.4422»
«BenzigerodeHeimburg_LN» «7.4695»
«Nordic_IA» «7.5404»
«Corded_Ware_Estonia» «7.7635»

Из всех палеогеномов наиболее близок к моему геном представителя унетицкой культуры. Происхождение унетицкой культуры до сих пор не выяснено. Между позднейшими энеолитическими культурами и унетицкой культурой существует типологический и хронологический разрыв. Наибольшее признание в результате последних исследований получило предположение, согласно которому в ее возникновении главную роль сыграли культура колоколовидных кубков и надиревская культура, распространенная в Венгрии (см. ниже). У культуры колоколовидных кубков и унетицкой имеется сходство в керамике, в погребальном обряде и в орудиях труда. Небольшую роль могла сыграть культура шнуровой керамики, хотя в целом они очень различаются. Закономерно, что следующими — хотя и с большим отрывом — близкими к моему геному группами палеогеномов являются геномы древних англосаксов (которые близки к древним скандинавам) и представителей чешского ареала культуры колоковидных кубков).
Аналогично, в режиме смешенных популяций хорошо заметны две тенденции. Во-первых, мой геном может быть представлен в виде комбинации палеогенома представителя позднебронзового века (Хальберштадт) и палеогеномов восточных охотников-собирателей эпохи энеолита, во-вторых как смесь 23.4% генома представителей балтийской позднебронзовой эпохи и все того же позднебронзового палеогенома из Хальберштадта

«86.4% Halberstadt_LBA + 13.6% Karelia_HG» «2.139»
«74.1% Bell_Beaker + 25.9% LesCloseaux13_Mesolithic» «2.1574» «35.9% Hungary_BA + 64.1% Poltavka_MBA_outlier» «2.319»
«65.7% Halberstadt_LBA + 34.3% Poltavka_MBA_outlier» «2.4387»
«83.2% Alberstedt_LN + 16.8% Karelia_HG» «2.443»
«23.4% Baltic_LBA + 76.6% Halberstadt_LBA» «2.4846»
«16.7% Europe_MN + 83.3% Poltavka_MBA_outlier» «2.4897»
«83.4% Halberstadt_LBA + 16.6% Samara_Eneolithic» «2.536»
«12.9% Halberstadt_LBA + 87.1% Unetice_EBA» «2.5603»
«16.1% Bell_Beaker_Czech + 83.9% Unetice_EBA» «2.5747»

2) файлы модели K11 и K16 для более сложной программы 4Admix (разработанной Александром Бурнашевом). Вторым инструментом вторичного анализа является 4Mix. Он работает по методу brute-force, шаг за шагом перебирая все возможные комбинации, а по окончанию цикла программа возвращает результат с наименьшим евклидовым расстоянием (по выбору можно использовать гауссово сглаживание, снижающее случайный статистический шум результатов). Как и в классическом Oracle, комбинация cмешиваемых этнических групп не может содержать более 4 популяций, хотя в отличие от классического Oracle, программа может моделировать комбинации из 3 и 4 этнических групп.

Пример. Приведу пример этих 3- и 4-членных аппроксимаций. В принципе, все то же самое, c той лишь разницей что теперь программа выделяет в комбинациях балтийскую и славянскую составляющую. Интересно, что скандинавская составляющая никуда не исчезла, оставаясь в пределах 20-25%
Using 3 populations approximation:
1 50% Belarusian_EastBelarus +25% English_Kent_GBR +25% Latvian @ 0.973956
2 50% Belarusian_EastBelarus +25% English_Kent_GBR +25% Lithuanian @ 0.988467
3 50% Latvian +25% French +25% Balt @ 1.036492
4 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Connacht @ 1.05259
5 50% Lithuanian +25% Sorb +25% French_West @ 1.059638
6 50% Belarusian +25% Icelandic +25% French_West @ 1.06158
7 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Cork_Kerry @ 1.074796
8 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_East +25% Irish_Connacht @ 1.076771
9 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Ireland @ 1.078576
10 50% Belarusian +25% Norwegian +25% French_West @ 1.079741
11 50% European_Utah +25% Lithuanian_Zemajitia +25% Balt @ 1.084317
12 50% Dane +25% Belarusian_EastBelarus +25% Lithuanian_Aukstajtia @ 1.090086
13 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Scottish_Highlands @ 1.093951
14 50% Lithuanian +25% North_European +25% Sorb @ 1.103744
15 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% English_GBR +25% French_Northwest @ 1.105369
16 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Scottish_Grampian @ 1.106616
17 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_Northwest +25% Irish_Connacht @ 1.106771
18 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_Northwest +25% Scottish_Dumfries_Galloway @ 1.108261
19 50% Lithuanian +25% French_West +25% Polish_West @ 1.113695
20 50% Latvian +25% North_European +25% Sorb @ 1.115164
31501779 iterations.
Using 4 populations approximation:
1Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Zemajitia+Swede+French_West @ 0.947002
2Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Sorb @ 0.971605
3Belarusian_EastBelarus+Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Latvian @ 0.973956
4Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Polish_East @ 0.986863
5Belarusian_EastBelarus+Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian @ 0.988467
6 French+Lithuanian_Zemajitia+Swede+Balt @ 0.98916
7Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Polish @ 0.996302
8 Belarusian+Lithuanian_Aukstajtia+Shetlandic+French_West @ 1.010485
9 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+Irish_Ulster+French_West @ 1.01227
10 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Ulster @ 1.012977
11 Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Aukstajtia+Swede+Welsh @ 1.013043
12Belarusian_EastBelarus+European_Utah+Lithuanian_Aukstajtia+Swede @ 1.013805
13Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Aukstajtia+Swede+French_West @ 1.018296
14German_NorthGermany+Lithuanian_Aukstajtia+Balt+French_West @ 1.026503
15 Lithuanian_Aukstajtia+Sorb+Ukrainian-Center+French_West @ 1.027473
16 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Connacht @ 1.031967
17Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Cork_Kerry @ 1.035716
18 French+Latvian+Latvian+Balt @ 1.036492
и т.д.
То же самое, но в модели K11
Using 3 populations approximation:
1 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Halberstadt_LBA +25% Hungary_BA @ 2.031302
2 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Bell_Beaker_Czech +25% Hungary_BA @ 2.072453
3 50% British_AngloSaxon +25% Halberstadt_LBA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.125791
4 50% Bell_Beaker +25% Bell_Beaker +25% LesCloseaux13_Mesolithic @ 2.209118
5 50% Halberstadt_LBA +25% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.244371
6 50% Halberstadt_LBA +25% Hungary_BA +25% Samara_HG @ 2.270667
7 50% Halberstadt_LBA +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Unetice_EBA @ 2.291406
8 50% Poltavka_MBA_outlier +25% British_AngloSaxon +25% Hungary_BA @ 2.30791
9 50% Bell_Beaker_Czech +25% Hungary_BA +25% Samara_HG @ 2.356281
10 50% Halberstadt_LBA +25% Nordic_BA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.358744
11 50% Bell_Beaker +25% Hungary_BA +25% Karelia_HG @ 2.369978
12 50% Bell_Beaker_Czech +25% Nordic_BA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.385823
13 50% Halberstadt_LBA +25% Corded_Ware_Germany +25% Nordic_BA @ 2.490915
14 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Hungary_BA +25% Unetice_EBA @ 2.503754
15 50% British_AngloSaxon +25% Bell_Beaker_Czech +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.53217
16 50% Halberstadt_LBA +25% Baltic_LBA +25% Halberstadt_LBA @ 2.540751
17 50% Hungary_BA +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Samara_HG @ 2.551414
18 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Alberstedt_LN +25% Hungary_BA @ 2.561557
19 50% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Unetice_EBA @ 2.575398
20 50% Bell_Beaker_Czech +25% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.575919
1127348 iterations.
Using 4 populations approximation:
1 Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Poltavka_MBA_outlier+Poltavka_MBA_outlier @ 2.031302
2 Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier+Unetice_EBA @ 2.03713
3 Bell_Beaker_Czech+Hungary_BA+Poltavka_MBA_outlier+Poltavka_MBA_outlier @ 2.072453
4 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier+Unetice_EBA @ 2.088049
5 British_AngloSaxon+British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.125791
6 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.131526
7 Bell_Beaker_Czech+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.14648
8 Bell_Beaker+Bell_Beaker+Bell_Beaker+LesCloseaux13_Mesolithic @ 2.209118
9 Bell_Beaker_Czech+Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.209365
10 Bell_Beaker_Germany+British_AngloSaxon+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.212982
11 Bell_Beaker_Czech+Bell_Beaker_Germany+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.232922
12 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.244371
13 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.254756
14 Alberstedt_LN+British_AngloSaxon+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.255589
15 Bell_Beaker_Czech+British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.256027
16 Halberstadt_LBA+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.270667

3) новым инструментом в релизе будет R программа nMonte, разработанная голландцем Гером Гизбертом. В отличие от двух предыдущих инструментов (ограниченных в числе используемых для моделирования этнических групп), nMonte позволяет использовать для моделирования (аппроксимации) генмоа все референсные грппы. Программа использует алгоритм эволюционного моделирования по методу Монте-Карло.
После пошагового добавления новой популяции программа определяет уменьшается ли евклидово расстояние; если да, то шаг сохраняется, в противном случае шаг отклоняется. Алгоритм завершает свою работу после выполнения примерно миллиона шагов. Как и два предыдущих инструмента программа стремится к минимализации евклидова расстония; но похоже за счет использования метода Монте-Карло, алгоритм гораздо более эффективен. И, также, как и в других инструментах, в nMonte «наилучшая комбинация» определяется как комбинация с наименьшим расстоянием. Недостаток же nMonte состоит в том, что она выдает только наилучшее подходящее решение, в то время как Oracle представляет альтернативные варианты.
Пример. Посмотрим, сколько потенциальных предковых популяций выдаст nMonte при аппроксимации моего генома.
При первом запуске программа выдала комбинацию (в cкобках процентный вклад референсной популяции) следующих 65 популяций. Также как и в других инструментах, тон задают балтийские популяции, а также белорусы, сорбы и поляки.

Lithuanian_Zemajitia 10.1
Latvian 7.85
Lithuanian_Aukstajtia 7.85
Belarusian_SouthBelarus 6.55
Lithuanian 6.5
Pole 5.45
Belarusian_WestBelarus 4.8
Balt 4.35
Sorb 3.35
Belarusian 3.05
Belgian 3
Norwegian 2.95
Czech 2.75
Dane 2.5
Slovak 2.4
Icelandic 1.9
Swede 1.9
French_SouthFrance 1.5
Slovenian 1.5
Basque_Spanish 1.3
Frisian 1.15
German_NorthGermany 1.1
Sardinian 1.1
Polish_East 1.05
Ukrainian_WestUkraina 1
Polish 0.95
Basque_French 0.9
Orcadian 0.7
Spanish_Pais_Vasco_IBS 0.7
Hungarian 0.65
Irish_Connacht 0.65
DonKuban_cossack 0.6
Dutch 0.6
Ukrainian_EastUkraina 0.6
Scottish_Argyll_Bute_GBR 0.55
European_Utah 0.5
English_GBR 0.45
Croatian 0.4
Russian-Pskov 0.4
French_South 0.4
Welsh 0.35
Irish_Ulster 0.35
Scottish_Fife 0.3
German_SouthGermany 0.25
Scottish_Dumfries_Galloway 0.25
Belarusian_CentralBelarus 0.2
Datog 0.2
English_Cornwall_GBR 0.2
North_European 0.2
Ukrainian 0.2
Russian_Orjol 0.15
Afar 0.1
Belarusian_EastBelarus 0.1
English_Kent_GBR 0.1
Irish 0.1
Kambera 0.1
Russian_Smolensk 0.1
Vindija 0.1
Belarusian-East 0.1
Spanish_Canarias_IBS 0.1
Spanish_Cantabria_IBS 0.1
Spanish_Cataluna_IBS 0.1
Peruvian 0.05
Russian_Voronezh 0.05

В K11 показаны следующие палеогеномы (или их группы). По-прежнему, основа генома 40% моделируется как геном представителя культуры колоколовидных кубков.

«Bell_Beaker» 40.3
«Halberstadt_LBA» 31.6
«Samara_HG» 8.5
«Tyrolean_Iceman_EN» 2.05
«Esperstedt_MN» 1.95
«Swedish_Mesolithic» 1.95
«BerryAuBac_Mesolithic» 1.85
«Swedish_Motala_Mesolithic» 1.7
«Bichon_Azillian» 1.6
«Continenza_Paleolithic» 1.5
«Hungary_BA» 1.5
«LaBrana_Mesolithic» 1.35
«Bell_Beaker_Germany» 1.05
«Hungary_HG» 0.85

4) следующим новым инструментом будет 4mix, более упрощенный вариант 4Admix. Он разработан тем же Г. Гизбертом. Основное отличие от 4Admix — если 4Admix перебирает все возможные комбинации из 4 популяций, то в 4mix можно эксплицитно задавать отдельные комбинации и определять евклидову дистанции между этой комбинацией и аппроксимируемым геномом в пространстве моделей
5) карты компонентов с аннотацией. Аннотации компонентов будут чуть позже, а вот карты уже готовы

Карты распространения некоторых компонентов K16 и K11  в ряде географических ареалов

6) я включил в релиз модифицированный скрип GPS лаборатории Элхайка для определения географического ареала происхождения предков человека, чей геном является предметом изучения. Я включил пару строчек кода для проецирования вычисленных географических координат на географическую карту.
Пример. Ниже показаны две карты, на которые спроецированы географические координаты вычисленной алгоритмом GPS (GPS DNA tool ) точки «этнического происхождения».
Я проверил работоспособность алгоритма на обеих моделях.
В модели K16 (современные популяции) GPS-координаты точки моего «происхождения» 49.7648663288835 32.4345922625112 (примерно 49 градусов северной широты и 32 градуса восточной долготы), т.е где-то на левом берегу Днепра в Украине. Как утверждают разработчики программы, она позволяет определить место происхождения с радиусом погрешности в 500 км. Я вычислил расстояние от полученной точки до настоящего места жительства предков (южная часть Брестской области) и получилось 470 км. Т.е точка попадает в радиус, хотя и с некоторым трудом.

Rplot

Что касается модели K11 (древние геномы), то в этой модели мой «Urheimat» локализуется — весьма ожидаемо — на землях древней унетицкой и лужицких культур (51.1254133094371 13.2336209988448)

Rplot

 

 

Программное обеспечение для работы с деградировавшей ДНК

Как известно, в последних работах опубликованных в 2015 году и посвященных анализу палеогеномов (древних геномов ископаемых останков) человека, авторы представили новую программу mapDamage2, созданную исследовательской группой Орландо в лаборатории Датского Института Геогенетики (Копенгаген).

Что это за программа и чем оправдано использование этой программы в лучших практиках (best practices) анализа палеогеномов?

mapDamage 2 представляет собой вычислительный фреймворк написанный на языках Python и R. Этот фреймворк позволяет отслеживать и измерять степень посмертного повреждения ДНК в сиквенсах древних ДНК в ридах, полученных на платформах секвенирования нового поколения. Как общеизвестно, обычно после смерти организма ДНК расщепляется эндогенными нуклеазами. Этого не происходит, если нуклеазы оказываются быстро разрушены или инактивированы, например, вследствие обезвоживания останков, низких температур или большой концентрации соли. Даже в этом случае ДНК со временем повреждается в результате случайного гидролиза или окисления. К гидролитическим повреждениям относятся разрушение фосфатного остова цепи, депуринизация (соответствующая позиция остается без азотистого основания) и дезаминирование.
Чаще всего происходит дезаминирование цитозина в урацил, метилированный цитозин (5-метил-цитозин) дезаминируется в тимин; реже аденин превращается в гипоксантин, который комплементарен цитозину, а не тимину, что ведет к неправильному прочтению при секвенировании. То есть в наших ридах за счет подобных «ложно-позитивных» срабатываний, в нормальном распределении снип-мутаций изменится отношение транзиций C>T и G>A к трансверсиям. Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная замена пиримидиновых оснований (тимин с цитозином).

Таким образом, предполагаемые дезаминированные позиции легко определить с помощью относительного простого алгоритма вычисления байесовских апостериорных вероятностей.

Сразу возникает вопрос: существуют ли методы уменьшения количества ложно-позитивных ридов, и таким образом повысить степень достоверности определения настоящих нуклеотидов в каждой из рассматриваемых базовых пар генома. В пакете mapDamage эта задача решается путем рекалибровки (снижения) значения так называемого PHRED score — меры «качества» прочитанной последовательности — в предполагаемых дезаминированных ридах.

Я решил проверить работоспособность программы на новых ирландских палеогеномах, — но к сожалению, возник ряд технических проблем (The Bayesian statistics program failed to finish), которые будет необходимо решить. В первом приближении кажется, что проблема вызвана несовместимостью пакетa ggplot2 и новой версии R, но я не уверен в этом.

Started with the command: mapDamage -i RSK2-A2.realign.bam -r ../hg19_new.fa —rescale
additional results_RSK2-A2.realign/Length_plot.pdf generated
Performing Bayesian estimates
Starting grid search, starting from random values
Adjusting the proposal variance iteration 1
Adjusting the proposal variance iteration 2
Adjusting the proposal variance iteration 3
Adjusting the proposal variance iteration 4
Adjusting the proposal variance iteration 5
Adjusting the proposal variance iteration 6
Adjusting the proposal variance iteration 7
Adjusting the proposal variance iteration 8
Adjusting the proposal variance iteration 9
Adjusting the proposal variance iteration 10
Done burning, starting the iterations
Done with the iterations, finishing up
Writing and plotting to files
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
The following from values were not present in x: col, color, pch, cex, lty, lwd, srt, adj, bg, fg, min, max
Error in postPredCheck(dat, mcmcOut) : could not find function «ggtitle»
Calls: source -> withVisible -> eval -> eval -> postPredCheck
5: postPredCheck(dat, mcmcOut)
4: eval(expr, envir, enclos)
3: eval(ei, envir)
2: withVisible(eval(ei, envir))
1: source(paste(path_to_mapDamage_stats, «main.R», sep = «»))
The Bayesian statistics program failed to finish

Генетический компонент северных евразийцев (ANE) в свете новых данных

Начало февраля порадовало важным событием: на  сервере Bioraxiv размещен препринт монументальной статьи Haak et al. (Iosif Lazaridis , Nick Patterson , Nadin Rohland , Swapan Mallick , Bastien Llamas , Guido Brandt , Susanne Nordenfelt , Eadaoin Harney , Kristin Stewardson , Qiaomei Fu , Alissa Mittnik , Eszter Bánffy , Christos Economou , Michael Francken , Susanne Friederich , Rafael Garrido Pena , Fredrik Hallgren , Valery Khartanovich , Aleksandr Khokhlov , Michael Kunst , Pavel Kuznetsov , Harald Meller , Oleg Mochalov , Vayacheslav Moiseyev , Nicole Nicklisch , Sandra L. Pichler , Roberto Risch , Manuel A. Rojo Guerra , Christina Roth , Anna Szécsényi-Nagy , Joachim Wahl , Matthias Meyer , Johannes Krause , Dorcas Brown , David Anthony , Alan Cooper , Kurt Werner Alt , David Reich) «Massive migration from the steppe is a source for Indo-European languages in Europe».  Несмотря на то, что сама статья еще находится на стадии препринта, уже сейчас очевидна глубина проработки материала. Нет никаких сомнений в том, что это объемное, вдумчивое и тщательное исследование  войдет в число главных работ в области индоевропеистики. По своей сути, коллектив авторов подвел в этой работе итоги всех предыдущих исследований введенных  «полных геномов» древних жителей Европы (возрастом в 8 000 -4 000 лет),  введенных в научных оборот за последние 2-3 года. Благодаря систематическому подходу к материалу и синтезу предыдущих наработок,  а также за счет использования  новейших физико-химических методов экстрагирования палео-ДНК вкупе с передовым современейшим биоинформатическим программным обеспечением,  авторы смогли строго и скурпулезно подойти к одному из важнейших вопросов истории, лингвистики и археологии — к вопросу о происхождении индоевропейцев.  К чести авторов, они признают, что даже после столь внушительного по своим размерам и качеству исследования, вопрос о первичном месте происхождения индоевропейцев остается открытым, и поэтому собственно обсуждение релевантности исследования палео-ДНК в свете существующих 4 главных теорий  происхождения индоевропейцев занимает в работе относительно мало места (стр.134-139).  Впрочем, вряд ли кто всерьез ожидал от этого исследования окончательного ответа на все вопросы индоевропеистики.  Тем не менее, подробный анализ аутосомного генома, а также однородительских маркеров (митохондриального генома и  Y-хромосомы) представителей целого ряда культур неолита, медногл и бронзового века восточной и западной Европы, и в особенности представителей Ямной культуры,  дает новую подпитку вечному спору между сторонниками разных версий происхождения индоевропейцев (т.к. многие вслед за Гимбутас связывают ямную культуру с общностью протоиндоевропейцев).

annurev-linguist-030514-124812.f2

Зато остальная часть этой 172-страничной работы настолько богата (насыщена) фактическим материалом, что любой, даже самый искушенный, читатель попгенетической литературы получит большое удовольствие от приобщения к плодам многолетней работы умнейших ученых.   А работа, действительно, проделана огромная. Ученые воссоздали геномные данные 69 европейцев, живших между 8 000-3000 лет тому назад, за счет обогащения амплифицированных библиотек палео-ДНК. Эти библиотеки палео-ДНК они использовали для целевого отбора  394577 таргентных полиморфизмов (снипов) в панелях Affymetrix Human Origins. Обогащение именно этих специально отобранных таргентных позиций позволило снизить необходимые для анализа древней ДНК объемы секвенирования в среднем примерно в 250 (!) раз, что позволило авторам изучить на порядок больше лиц в сравнении с предыдущими исследованиями, и получить более полные знания о прошлом.

map

В работе показано, что уже 8,000-5,000 лет  назад население западной и восточной Европы следовали противоположным траекториям развития.

На заре евпропейского неолита, примерно 8,000-7,000 лет назад, отдельныетесно связанные родством и отличные от коренных европейских охотников-собирателей, группы  ранних земледельцев появились в Германии, Венгрии и Испании, в то время как Россия была населена особой группой восточных охотников-собирателей, имеющих родство с населением сибирского палеолита (24 000 л.н.в) , эта группа древних северо-евразийцев (ANE), представлена образцом MA1 (мальчик с палеолитической стоянки Malta-1 из южной Сибири); кроме того, этот компонент неплохо аппроксимируется «сибирской частью» генома изолированных индейцев Южной Америки (каритиана). Два образца охотников-собирателей из России (Карелия и Самары) образуют кластер «восточно-европейских охотников-собирателей «(EHG); пост-мезолитические охотники-собиратели  из Люксембурга, Испании и Венгрии (WHG) находятся на противоположенном конце клина охотников-собирателей, в то время как охотники-собиратели  Швеции  (SHG) находятся посередине. Интересно отметить, что геном охотника-собирателя из Карелии представляет собой смесь 38-40% компонента ANE и 60-62% компонента WHG, причем величина ANE значительно выше 20% ANE, выведенных для  шведского-охотника собирателя Motala-12 в предыдущем исследовании Lazaridis et al 2014).
В соответствии с тем, что EHG являются обмен население больше аллелей с «древних Северной евразийцев» (ГУ 7), чем любой другой.

pca

Примерно  6-5 тысяч лет назад,  на большой части  Европы назад  произошел новый «подъем» потомков мезолитических охотников-собирателей, но в России  степные скотоводы Ямной культуры время произошли от смешивания  предыдущих племен восточно-европейских охотников-собирателей с населением ближневосточного происхождения.  Население Ямной культуры отличалось от своих предшественников -восточно-европейских охотников-собирателей EHG —  меньшим количеством обших аллелей с MA1 (| Z | = 6,7), что  свидетельствует о процессе дисперсии носителей ANE  на территории европейских степей где-то между 5 000-3 000 гг. до н.э. Уменьшение числа общих с образцом MA1 аллелей, вероятно объясняется появлением «примеси» от популяции или популяций, тесно связанных с
популяциями современного ближнего Востока, т.к. самая отрицательная f3-статистика  (отрицательная статистика однозначно свидетельствует о примеси) наблюдается при моделировании жителей Ямной культуры как продукта смешивания носителей компонента EHG  и современных популяций ближнего Востока, таких как армян (Z = -6,3).

Непосредственный контакт между населением западной и восточной Европой состоялся   ~ 4500 лет назад, а в геноме поздне-неолитического населения культуры шнуровой керамики на территории Германии прослеживается 75%-ный «генетический» вклад «степного» компонента представителей ямной культуры. Таким образом геном жителей культуры шнуровой керамики «документирует» массовую миграцию населения с восточной периферии Европы в ее центральные области. Данный «степной» компонент Yamna (гибрид EHG и ближневосточных популяций) сохранялась в значительных пропорциях у всех имеюшисхя образцах из центральной Европы как минимум до ~ 3000 г.н.э, и повсеместно встречается у современных европейцев.

 

admix2

 

Если географическая дихотомия неолитического и мезолитического генетических компонентов в Европе была отмечена еще в работах пионеров популяционной генетки вроде Л. Кавалли-Сфорца, то данные этой работы позволяют вставить последнее звено в решении головоломки. На основании данных можно предположить, каким именно образом третий генетический компонент европейцев (ANE) попал из Сибири  в Европу: сначала этот компонент несли представители EHG,  затем он перешло к «ямникам» (смешанная популяция восточно-европейских охотников-собирателей и населения ближневосточного типа), а затем от ямников к представителям культуры шнуровой керамики, которые представляли собой смесь представителей ямной культуры с средне-неолитическими европейцами.  В настоящее время этот компонент имеет плавное распределение на территории Европы, и по этой причине, мы можем использовать его в анализах структуры как генофонда целых народов, так и генома отдельно взятых людей.

В январе я провел небольшой  эксперимент c «чистым вариантом» аутосомного компонента ANE (ancestral North-Euarasians), впервые описаном в известной работе Lazaridis et al. 2014. Процедура вывода третьего генетического компонента в генофонде европейцев (ANE) оказалась гораздо сложнее, чем я предполагал в начале. Основная сложность заключалась в том, что в отличии от мезолитических и неолитческих сэмплов, у нас нет хорошого образца палеоДНК носителей компонента ANE. Пришлось заниматься реконструкцией генома, используя в качестве заменителей геном MA1 и не-восточноазиатскую часть генома индейцев каритиана. Технически, данный «компонент» был «синтезирован» в программе Plink с помощью 2последовательных запусков генерации «синтетических» популяций на основании частот аллелей аутосомных снипов, вычисленных в3 последовательных запусках программы Admixture.

Я получил компонент с максимально приближенным значениями к значениям компонента ANE в разных популяциях мира в работе Lazaridis et al. 2014. Изучение этого компонента важно для понимания многих неясных моментов истоии древних популяций в восточной Европе и на северном Кавказе. Последние статьи и анонсы лаборатории Давида Рейха к новой статье о составляющих аутосомного генофонда представителей ямной культуры и культуры шнуровой керамики дают основания полагать, что компонент ANE в Евразии могли разносить потоки миграции индоевропейцев, а генетическое разнообразие жителей Европы и Кавказа практически вписывается внутри класссического треугольника (клинов) генетических компонентов ANE-WHG-EEF (см.  ниже график PCA).

10896832_10205857624789575_5582535068712806983_n

Формально,эта гипотеза проверяется с помощью инструментов f3-статистики (A; B,C) — формального теста на статистическую значимость предполагаемого варианта присутствия адмикса двух популяций-доноров в популяции-рецепиенте.

Я решил проверить надежность модели путем представления ряда европейских и кавказских популяций в виде продукта гибридизации носителей компонента ANE с «неолитическим» и «пост-мезолитическим» населением Европы (результаты ниже,  Z в последней колонке.

 

North-Caucas Caucasian ANE -0.0006748 5.13E-05 -13.166
Mesolithic-North Loschbour ANE -0.0011573 0.0001605 -7.21171
Mediterranean-Neolithic Otzi ANE -0.0012012 0.0002376 -5.05634
Mesolithic-North LaBrana ANE -0.0010358 0.0002097 -4.94043
Italian-East Otzi ANE -0.0012473 0.0005013 -2.48825
Italian-East Italian-West ANE -0.0005022 0.0004325 -1.16129
Maltese Otzi ANE -0.0001611 0.0004147 -0.388512
Assyrian-1 Caucasian ANE -0.0002994 0.0009656 -0.310081
Spanish-Canar Loschbour ANE -0.0002557 0.0011264 -0.227017
Italian-East Maltese ANE 2.36E-05 0.0003026 0.0779574
Italian-East Caucasian ANE 6.32E-05 0.000274 0.230808
Spanish-Canar Otzi ANE 0.0003307 0.0012476 0.265081
Assyrian-1 Italian-West ANE 0.0003321 0.0012207 0.272035

Практически все полученные варианты для современных популяций в тесте f3 дали отрицательную Z-оценку.

Буквой Z обозначается стандартная оценка, основанная на нормальном распределении. Иначе говоря, Z-o. является мерой отклонения от среднего, выраженной в единицах стандартного отклонения. Z –оценка будет иметь отрицательную величину, если показатели адмикса будут выше медианного значения.
Очень высокие или очень низкие (отрицательные) Z-оценки, связанные с очень маленькими p-значениями, располагаются в хвостах нормального распределения, и является значимыми, а не случайными. А значит, компонент ANE был индуцирован мною правильно.

 

 

Что еще любопытно, так это то, что третья составляющая современных европейцев — компонент ANE в моем эксперименте плавно разделился на две подсоставляющих — MA1 (древние сибиряки эпохи палеолита) и Кавказ (в качестве основы я брал геномы грузин и армян).

То есть, скорее всего компонент ANE появился в результате смешивания «труъ» древних северных евразийцев и кавказцев. Собственно, об этом намекал Рейх в анонсе своей публикации результатов анализа геномов жителей ямной культуры.

Вероятно, что кавказские популяции (особенно в Дагестане), характеризующиеся высоким уровнем гомо- и аутозиготности в определенном смысле «законсервировали» в своем геноме тот первый массовый вброс компонента ANE в свой генофонд. И по этой причине, например, без специальной методики, в программе Admixture практически весь компонент ANE маскируется бимодальным компонентом, вроде знаменитого Caucas-Gedrosia в одном из первых этно-популяционных калькуляторов проекта Dodecad. Похоже, что генетика может в очередной раз частично примирить две антиномные теории (вернее, целые кластеры теорий) происхождения ИЕ — анатолийскую и степную. Нечто подобное наблюдалось после прочтения геномов неандертальцев и получения убедительных фактов гибридизации предков соврменного человека и архаических гомининов — неандертальцев, денисовцев. В результате чего теории мультирегионального и монорегионального происхождения человка были хотя бы в отдельных моментах приведены к общему знаменателю.

Как я уже упоминал ранее, мой опыт с «выведением» предкового аутосомного компонента индоевропейцев полностью удался. Поскольку всем очевидно, что этот компонент родственен «североиндийскому предковому компоненту» (ANI — обозначение из статьи Reich et al. 2009 и Moorjani et al 2011) о структуре генофонда индийских этнических групп), я взял 10 индийских этнических групп, имеющихся в кураторском наборе лаборатории Райха и проанализировал эту выборку в Admixture на пропорции вхождения их геномов в 2 априорно заданные кластеры. Первый кластер ANE был априорно задан 40 синтетическим индивидами, сгенерированными в программе Plink на основании расчитанных ранее частот аллелей «чистого» компонента ANE. В качестве дополнительного контрольного образца я использовал геном Malta1, т.к. он содержит в себе наивысшее содержание компонента ANE. Второй кластер был задан 4 индивидами Onge (одна из аборигенных народностей Андаманских островов). Как неоднократно указывалось в литературе, именно жители Андаманских островов являются самыми «чистыми» носителями т.н «южно-индийского» предкового компонента ASI (на континенте чистых носителей этого «компонента» не осталось, в том числе и среди популяций дравидов, ведда и мунда). После нескольких экспериментов по эвристическому методу проб и ошибок, я получил более или менее приемлимое разделение индивидов на 2 кластера, а затем вычислил частоты аллелей в каждом из этих кластеров. Любопытно, что в ходе опыта, удалось не только выделить компонент ANI, но и добиться неплохого уровня дискримнации между компонентом ANI, ANE, и благодаря этому, оба компонента могут быть включены в мой следующий этно-популяционный калькулятор.

Надежность компонентов я проверил на собственных данных. В рабочей модели калькулятора K14 удельное распределение этно-генографических компонентов моего генома выглядит следующим образом:

68.75% — европейский мезолитический компонент
13.12% — северо-евразийский компонент ANE
10.23% — европейский неолитический компонент
4% — ANI (северо-индийский предковый компонент)
1.6% — кавказский компонент
1.2% — алтайский компонент
0.2% — сибирский компонент

R Graphics Output