Окончание процесса фазирования и импутирования геномов

К середине мая этого года я закончил трудоемкий процесс импутации сборной солянки из 9000 публично доступных образцовых представителей  700 различных человеческих популяций, генотипированных в разное время на разных снип-платформах (главным образом — Illumina и Affymetrix)
Строго говоря, я планировал завершить этот этап работы намного раньше, но в ходе выполнения работ возник ряд обстоятельств, помешавших завершить этот этап в срок. Главным из них является смена сервера где я выполнял импутирование геномов. Я начал работать на сервере Мичиганского университета, однако в ходе процесса перешел на аналогичный сервис Института Сэнгера (имени того самого нобелевского лауреата, предложившего первый метод полного сиквенирования генома).
Это решение было продиктовано необходимостью использовать новейшую референсную панель аутосомных гаплотипов — Haplotype Reference Consortium (в нее входит примерно 30 тысяч, а после предстоящего этим летом обновления — свыше 50 тысяч — аутосомных геномов, т.е свыше 60 тыс. гаплотипов). Надо сказать, этнический состав выборки референсных геномов впечатляет, хотя и там по-прежнему наблюдается перекос в сторону европейских популяций. К сожалению, и эта новейшая выборка представлена преимущественно европейцами (поэтому вероятность  импутированных генотипов для европейских популяций оказались лучше аналогичных результатов в африканской и азиатской когортах), однако даже с учетом этого обстоятельства ее надежность в определении негенотипированных аллелей снипов выше 1000 Genomes (не говоря уже о HapMap):

1	UK10K	3715	3781	6.5x
2	Sardinia	3445	3514	4x
3	IBD	4478	4478	4x + 2x
4	GoT2D	2710	2974	4x/Exome
5	BRIDGES	2487	4000	6-8x (12x)
6	1000 Genomes	2495	2535	4x/Exome
7	GoNL	748	748	12x
8	AMD	3305	3305	4x
9	HUNT	1023	1254	4x
10	SiSu + Kuusamo	1918	1918	4x
11	INGI-FVG	250	250	4-10x
12	INGI-Val Borbera	225	225	6x
13	MCTFR	1325	1339	10x
14	HELIC	247	2000	4x (1x)
15	ORCADES	398	399	4x
16	inCHIANTI	676	680	7x
17	GECCO	1131	3000	4-6x
18	GPC	697	768	30x
19	Project MinE — NL	935	1250	45x
20	NEPTUNE	403	403	4x
	Totals	32611	38821
22	French-Canadian	2000	5-6X	End 2014
23	Converge	12000	1x	Now
24	UG2G Uganda	2000	4x	2015
25	Arab Genomes	100	30x
26	Ashkenazi	128	CG	Now
27	INGI-Carlantino	94	4x	Now
28	CPROBE	80	80	4x

 

Cледуя рекомендациям, я получил набор из 9000 образцов, каждый из которых включает в себя набор из 20-30 миллионов снипов. К сожалению, из-за субоптимальности результатов в некоторых выборках (Xing et al, Henn et al. и ряде других), их придется исключить из тех видов анализа, которые требует максимальной точности исходных данных. Импутированные генотипы (выраженные через оцененные вероятности) были трансформированы с помощью программы Plink 1.9 в генотипы, причем выбирались варианты полиморфизмов с вероятностью 0.8 (—hard—call—threshold 0.8)

Для оценки полезности импутированных генотипов для популяционного анализа я использовал метрику nearest в программе Plink (матрица с дистанцией между ближайшими геномами) и кластерограммы IBS (идентичности по генотипам).

Таблица метрики nearest (Z-статистика)

А это кластерограмма с хорошо видно географической локализацией кластеров. Я использовал для кластеризации матрицы IBS несколько разных алгоритмов — наиболее убедительный вариант был получен с помощью алгоритма Ward

Другие варианты топологии кластерограмм в формате NEWICK и TRE можно посмотреть здесь (их можно открыть в любой программе для визуализации филогенетических деревьев).

Таким образом, для некоторых типов анализа в популяционной генетике использование импутированных снипов может сослужить хорошую службу, смягчая (или, наоборот, увеличивая) градиент частот аллелей).

Дополнительные анализы — fastIBD, IBS, анализ главных компонентов — образцов в выборке, только подтверждает это наблюдение:

Но самое лучшее подтверждение надежности импутированных снипов для анализа компонентов происхождения  было получено с помощью p-теста Z-статистики во время оценки правильности определенной топологии дерева компонентов (с допущением фактора смешивания предковых компонентов). Для этой цели я использовал стандартный инструмент — программу TreeMix. Я использовал только те снипы, которые встречаются в моей контрольной выборке (референсов каждого из компонента) с частотой выше 99 процентов. Как видно из нижеприведенного графика, компоненты выбраны правильно, а топология определяется практически безошибочно, несмотря даже на малое количество снипов (6 тысяч). Правильно определились и направления потоков генов, дрейфов генов (указаны стрелками). Тут в принципе мало нового — большинство этих эпизодов уже были описаны в отдельных работах генетиков. Так, виден поток генов от «денисовского» человека к усть-ишимцу, от которого в свою очередь идет поток генов к австралоидным популяциями. То есть денисовская примесь у папуасов могла достаться от сибирских популяциях близких к «усть-ишимцу». Виден также вклад ANE/EHG в геном североамериканцев -в интервале 10-15 процентов.

Принципально новым является лишь определенный программой дрейф генов в направлении от африканцев Khoisan к североафриканцами (в качестве референса которых взяты египтяне, бедуины и алжирцы). Скорее всего, это и есть тот самый пресловутый сигнал «египтского выхода» человечества из Африки, о котором недавно писалось в новейшей статье, а сам компонент -идентичен пресловутому Basal-Eurasian component

В начале июля  в связи с публикацией препринта о генофонде древних ближневосточных земледельцев решился все таки подписать заявление на имя Давида Рейха и Иосифа Лазаридис с ходатайством о доступе к полной версии их выборки (она включает много новых интересных для меня популяций — например, около сотни новых образцов шотландцев, шетландцев, ирландцев из разных областей Ирландии, немцев, сорбов и поляков из восточной и западной Польши).

Г-н Лазаридис был весьма любезен и буквально на следующий день после получения подписанного заявления предоставил мне доступ к этим данным. Я займусь их плотным изучением чуть позже. А пока любопытно посмотреть результаты пилотного Admixture анализа 5900 публичных доступных образцов. В качестве проверки надежности своего нового метода изучения древних и современных популяций людей, я провел 4 параллельных анализа Admixture c разным дефолтным значением предковых популяций (K).

Разумеется, в нашем случае число компонентов K заведомо больше 3, авторы статьи эмпирически показали что меньший разброс значений был получен при K=11. Поэтому я исходил из этой цифры, назначив три разных значения K — 10,11,13.
В первом варианте я использовал т.н unsupervised режим Admixture, т.е. программа должна была сама угадать и реконструировать частоты аллелей снипов в 10 реконструируемых предковых «компонентах» популяций.

Как и ожидалась, таковыми оказались африканский (пик у пигмеев и бушменов), америндский (пик у эксимосов и американских индейцев), сибирский (пиковые значение у нганасанов), южно-индийский компонент (пик в народностях Paniya и Mala), австрало-меланизийский, южно-восточноазиатский, три западно-евразийских компонента — 2 компонента западноевроп ейских и кавказских охотников-собирателей и неолитический; и наконец ближневосточный.

Разумеется, за исключением трех компонентов с пиками в древних геномах, данное распределение отражает cовременное распределение предковых компонентов.

Пришлось вручную выделять из ближневосточного компонента популяцию базальных европейцев (в качестве основы я взял геномы натуфийцев, т.е ближневосточный компонент — Levant_N — может быть разложен на два отдельных предковых компонента — неолитический и мезолитический «натуфийский»), а затем сгенерировать гипотетическую популяцию из 20 образцов состоящих на 100 процентов из натуфийского компонента. Именно этот компонент был включен в модель K11 под названием Levant_Mesolithic ( или Natufian). Этот компонент не стоит путать с компонентом Basal-Eurasian в калькуляторе Eurogenes K7 Basal-rich, так в в моей модели K11 основная часть базального компонента ушла в неолитические компоненты (т.е Natufian=Basal-Rich — Neolithic)

Гораздо сложнее ситуация обстояла с разделением компонента кавказских охотников-собирателей, которые наряду с американскими аборигенами несут в своем геноме значительные доли компонента древних северо-евразийцев. По этому причине очень сложно, например, разделить восточных охотников-собирателей (из мезолитических культур Карелии и Самары) и синхронным им кавказских охотников-собирателей.
Из-за присутствия компонента древних северо-евразийцев в их геноме, в Admixture компонент древних кавказцев увеличивается только за счет компонент восточных охотников-собирателей — и наоборот. Правда, можно попытаться выделить отдельный мезолитический компонент населения горного Загроса (Иран).

В случае успеха древние геномы жителей мезолитической Грузии можно будет представить как 20% компонента степных охотников-собирателей + 80% местного мезолитического субстрата.

Вторая фаза нового проекта

Две недели назад я сообщил об окончании первой фазы своего нового проекта (на первом этапе работы удалось собрать надежную выборку из более чем 5000 образцов более чем 250 различных этно-популяционных групп людей по всему миру.

Как я уже рапортовал ранее, самой сложной из запланированных на втором этапе задач являлась импутирование (импутация) отсутствующих генотипов.  Читатели моего блога помнят, что две предыдущие экспериментальные попытки импутирования больших выборок     — в 2013  и в 2015  — закончились неудачно (или, если говорить точнее, качество импутированных генотипов не оправдало моих завышенных ожиданий). В предыдущих опытах я задействовал мощную комбинацию программ ShapeIT и IMPUTE и  метод импутирования снипов за счет использования большой референсной панели аутосомных гаплотипов (из 1000 genomes),  гарантирующей более аккуратное определение генотипов.

На этот раз, я решил не повторять ошибок, и обратился к использованию других программ — в частности , к  Minimac3, хорошо зарекомендовавшую себя в работе с геномами 1000G.  К моему счастью, я набрел на недавно появившиеся публичные сервера, работающие с «облачным» сервисом импутирования Cloudgene. геномов.
Серверы импутирования геномов позволяют использовать полную референсную панель гаплотипов для точного определения недостающих генотипов в анализируемых данных. Пользователи подобных серверов могут загружать (предварительно фазированные или несфазированные) данные генотипов на сервер. Процедура импутирования  будет осуществляться на удаленном сервере, и по окончанию этого процесса рассчитанные данные доступны пользователю для скачивания. Наряду с импутированием, подобные сервисы позволяют провести процедуру контроля качества (QC) и фазировки данных в качестве предварительного этапа процесса импутирования генотипов.

Прототипы серверов импутирования уже доступны в институте Сангера и Мичиганского университета. В дополнение к вышеназванным серверам, можно упомянуть прототип сервера поэтапной полномасштабной  фазировки генотипов анализируемых образцов (прототип создан биоинформатиками Оксфордского университета). На мой взгляд, самое простое и доступное решение задачи импутирования на удаленном сервере было разработано сотрудниками   Мичиганского университета. Дополнительное преимущество этому решению дает грамотная документация по использованию сервиса.

Основная рабочая лошадка сервиса — это комбинация двух или трех программ — две програмы для фазирования диплоидных генотипов в гаплоидную фазу  ShapeIT и Hapi-UR , а в качестве основного ПО для самого процесса импутирования (определения) недостающих генотипов — вышеупомянутую программу Minimac3.

Описание эксперимента с импутированием генотипов на удаленном сервере

В самом начале,  я разбил свою выборку на пять когорт (т.к. референсные панели на сервере также разбиты на «этнографические группы»):

1. европейцы (европейцы + кавказцы) — 1715 образцов -87169 снипа
2. азиаты (+американские аборигены и аборигены островов Тихого Океана) — 2356 образцов — 87044 снипа
3. африканцы — 1054 образца — 86754 снипов
4. палеогеномы древних жителей Евразии, Африки и Америки -340 — 594500 снипов
5. смешанные группы — преимущественно мозабиты, пуэрто-риканцы и др.

На рисунке показана корреляция между частотами аллелей в изучаемоей выборке (здесь: европейская когорта) и частотами аллелей в референсной панели

К моему вящему неудовльствию,  некоторые образцы в сводной выборке не прошли контроль качества — в первую очередь это касается образцов европейцев из базы данных POPRES, а также выборок статьи  Xing et al. (2010). Скорее всего, их нужно будет импутировать отдельно.

Несмотря на значительную скорость обработки генотипов на удаленном сервере, к настоящему времени эксперимент еще не доведен до конца.  Пока я планирую ограничиться импутированием генотипов в 3 первых когортах (т.к. импутирование палеогеномов с помощью современных референсных панелей гаплотипов вероятнее всего приведет к искажению истинного разнообразия палеогеномов за счет проекции на современные группы населения, хотя авторы статьи Gamba et al. 2014 в сопроводительном материале к своей статье утверждают обратное).

После окончания фазирования и последующей обработки генотипов европейской когорты в программе Plink (были отсеяны все варианты с вероятностью ниже 0.9) ,  я получил выборку из 1715 европейцев с 25 215 169 снипами против изначальных 87169, т.е число снипов в выборке увеличилось в 290 раз!
В азиатской когорте соотношение импутированных генотипов к исходным составило чуть меньшую величину 19 048 308 / 87044 = 219.

Проверка результатов

Разумеется, все полученные результаты нуждались в дополнительной проверке качества генотипирования.
Cначала я объединил импутированную европейскую когорту с когортой палеогеномов (которая не была импутирована) и рассчитал в программе PLINK 1.9 матрицу IBS (т.е. сходства образцов в выборке между собой, эта метрика отдаленно напоминает Global Similarity в клиентских отчетах 23andme), а затем усреднил данные по популяциям и произвел по усредненным значениям иерархическую кластеризацию по признакам сходства (IBS, identity by state). Результат превзошел все мои пессимистические ожидания

 

 

Как становится очевидно из приведенной выше кластерограммы,  в целом взаимное расположение популяций в кластерах соответствует (в общих чертах) взаимному географическому положению. Присутствуют, правда, и некоторые огрехи. Так, например, венгры очутились в одном кластере с русскими из Курска,  норвежцы — с русскими из Смоленска, а усредненные «русские» — с американцами европейского происхождения из штата Юта и французами. Трудно сказать, в чем здесь причина, тем более что матрица была составлена по значениям IBS (идентичности по состоянию), а не IBD (идентичности по происхождению).  Более подробные данные о попарных значениях IBS между популяциями выборки можно посмотреть в этой таблице

Импутированная азиатская когорта (несмотря на расширение географии за счет включения образцов коренного населения Америки и аборигенов бассейна Тихого океана)  тоже  оказалась на удивление надежной. Я пока не буду останавливаться на подробностях изучения этой когорты, вместо этого я размещаю здесь результаты MDS- мультдименсионального шкалирования образцов выборки, образованной в ходе слияния 2 импутированных когорт (европейской и азиатской) с 1 неимпутированной (палеогеномы). Цветовое обозначение точек соответствует определенным кластерам, выявленных в выборке с помощью алгоритма MCLUST (cледуя рекомендациям Диенека Понтикоса). Всего этих кластеров 15 и они обозначены последовательностью чисел от 1 до 15, и каждый из этих кластеров имеет свою четкую географическую привязку:

• 1 — кластер популяций ближнего Востока и  Анатолии
• 2 — кластер популяций северного Кавказа
• 3 — «индоевропейский» кластер древних популяций Синташта, шнуровой культуры, Ямной культуры и т.д.
•  4 — кластер аборигенных жителей Америки (эскимосов и индейцев)
• 5 — суперкластер популяций средиземноморского и восточноевропейского региона
• 6 — сибирский кластер алтайских и самодийских популяций
• 7 — кластер популяций западной и северной Европы
• 8 — кластер палеосибирских популяций (таких как чукчи, ительмены и коряки)
• 9 — кластер аборигенных (австронезийских и тай-кадайских) популяций юго-восточной Азии (даи, атаяла и ами)
• 10 — кластер неолитических популяций
• 11 — еще один ближневосточно-средиземноморский кластер (ашкеназим, сардинцы и так далее)
• 12 — кластер североиндийских популяций
• 13 — кластер центральноазиатских популяций
• 14 — поволжские популяции
• 15 — разные групп индусов