Скрытые возможности клиентских данных 23andme в плане молекулярной диагностики.

Компания 23andme не нуждается в особом представлении читателям этого блога. Вплоть до конца прошлого года компанию занимало существенный сегмент рынка персональной геномики, ориентированного на предоставление  клиентам информации о генетических медицинских рисках (genetic risks) и генетической генеалогии (genetic origin). Информация о медико-генетических рисках содержалась в ряде сервисов портала компании, а также в доступном для скачивания отчета о генетических рисках и, разумеется, в первичных данных генетического отчета, в котором содержались значимые с точки зреемя медико-генетического диагностирования генетические полиморфизмы (SNP).

Всвязи с известными событиями и последующим за ними предписанием USA Food and Drug Administration (FDA) компании 23andme о запрете выпуска на рынок услуг персонального геномического диагностирования своего «медицинского девайза» (т.е интерпретации медико-генетических рисков развития заболеваний), компании пришлось сузить свою сферу деятельности до оказания генетико-генеалогических услуг.

Несмотря на это досадное обстоятельство, сказавшееся нелучшим образом на динамике увеличения клиентской базы компании,  нужно помнить, что все клиенты сохранили доступ к своим первичным данным тестирования (т.е списку снипов с генотипами). И при вдумчивом, творческом подходе любой человек может не только «вытащить» из этих «cырых данных» важную с точки зрения медицины информацию, но и заменить спомощью полученной информацией результаты более традиционных тестов.

Каковы могут быть варианты использования данных 23andmе не в привычных генеалогических целях, а скажем для получения сведений, который могут впоследствии пригодится для молекулярного диагностирования?

Я приведу пару примеров такого использования.

Определение HLA-фенотипа.

На мембране клеток организма присутствуют продукты генов всех локусов, размещенных на обеих нитях 6-й хромосомы.

 

 

Это означает, что HLA-гены наследуются по кодоминантному типу, т. е. одну хромосому ребенок наследует от матери, а другую – от отца. Как уже упоминалось, совокупность генов, расположенных на одной хромосоме, составляет гаплотип. Таким образом, у человека два гаплотипа и каждая клетка организма несет на себе диплоидный набор антигенов системы HLA, один из которых кодируется HLA-генами матери, а другой – отца. Исключение составляют половые клетки (яйцеклетка и сперматозоид), каждая из которых содержит в своем ядре только по одному гаплотипу.

Антигены гистосовместимости, выявляемые на клетках конкретного человека, составляют HLA-фенотип. Для его определения необходимо произвести фенотипирование клеток индивида. Как правило, “типируются” лимфоциты периферической крови. До настоящего времени в большинстве лабораторий HLA-A. В, С и DR-антигены определяют при помощи серологических методов, в частности, лимфоцитотоксического теста. тот тест основан на способности анти-НLА-антител в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты. Гибель клеток демонстрируется при помощи добавления трипанового синего. При этом мертвые поврежденные клетки окрашиваются, и под микроскопом учитывается их количество.

Эти тесты часто требуются в ходе стандартных медицинских процедур обследования во время начала беременности, или для изучения этологии аутоимунных заболеваний. Еще более важно определение гистосовеместимости в транплантологии, где типирование HLA-фенотипа  донора является обязательным условием.

Однако, с приходом новых микроматричных технологий опеределния нуклеотидов ДНК и биоинформатических методов рутинной обработки последовательности человеческих геномов , появился дешевая и относительно простая альтернатива классическим серологическим тестам (которые стоят в интервале от 100 до 500 долларов).

Я не буду останавливаться на принципиальном описании процедур, с помощью которых на основании данных 23andme можно с помощью метода «импутирования» определить HLA-фенотип, так как в прошлом году я уже разместил в этом блоге пошаговую инструкцию для выполнения этой задачи.

Впрочем, уже после того, как  я отписался на эту тему здесь,  в департаменте биостатистики Университета Вашингтона был разработан алгоритм HIBAG который принципиально мало чем отличается от алгоритма HLA*IMP (в обеих алгоритмах используется training model, позволяющая определять фенотип HLA по снипам 23andme).  Входные данные программного решения этого алгоритма (язык R) представляют собой формат Plink. А так как в последней версии Plink была включена нативная поддержка формата 23andme, то преобразовать данные 23andme в бинарный формат Plink не сооставит особого труда. Что касается обработки данных в HIBAG, то примерный порядок выполнения команд выглядит следующим образом:

# Load the published parameter estimates from European ancestry
model.list <- get(load(«European-HLA4.RData»))#########################################################################
# Import your PLINK BED file
#
yourgeno <- hlaBED2Geno(bed.fn=».bed», fam.fn=».fam», bim.fn=».bim»)
summary(yourgeno)

# HLA imputation at HLA-A
hla.id <- «A»
model <- hlaModelFromObj(model.list[[hla.id]])
summary(model)
# HLA allele frequencies
cbind(frequency = model$hla.freq)

# SNPs in the model
head(model$snp.id)
# «rs2523442» «rs9257863» «rs2107191» «rs4713226» «rs1362076» «rs7751705»
head(model$snp.position)
# 29525796 29533563 29542274 29542393 29549148 29549597

# best-guess genotypes and all posterior probabilities
pred.guess <- predict(model, yourgeno, type=»response+prob»)
summary(pred.guess)
pred.guess$value
pred.guess$postprob

 

 

Панель метилирования Яско

В последние 10 лет, крупные генетические исследования выявили сотни генных мутаций, которые возникают чаще у аутичных пациентов, чем в общей популяции. Тем не менее, каждый пациент имеет только одну или несколько из этих мутаций, что затрудняет разработку лекарств против болезни. В настоящее время, изучением генетических факторов аутизма занимается большое количество врачей-генетиков,  одним из них является доктор Эми Яско занимается исследованиями генных мутаций у аутистов. Как показали многочисленные молекулярно-генетические обследования и спектрометрия аминокислот, органических кислот и карнитинов, значительное количество аутистов страдает метаболическими нарушениями.  Есть виды аутизма, вызываемые именно этими генетическими нарушениями обмена вещест.

Доктор Эми Яско разработала тест на панель метиляции Яско — тест этот дорогой, стоит 500 долларов, в этой проверяют что-то около 30 генных полиморфизмов (снипов). Выбор снипов в этой панели мотивирован тем, что эти снипы связаны с  определенными генами на «молекулярно-биохимическом пути метиляции» (methyliation pathway),  т.е генами которые влияют на способность организма выполнять ряд ключевых биохимических функций. Наличие генетических дисбалансов,  т.е снипов в пути метиляции, будет ограничивать эффективность пути метиляции.

 

 

К счастью клиентов 23andme, чипсет снипов этой компании включает в себя если не все, то большую часть снипов панели Яско.
Один из проектов, возникший всвязи с неудовлетворенной потребностью клиентов в более развернутой и детальной обработке данных 23andme, Genetic Genie предлагает  условно-бесплатный сервис с помощью которого данные релевантных снипов можно привести к  традиционному виду таблицы с отчетом по панели Яско:

Gene & Variation	rsID	Alleles	Result
COMT V158M	rs4680	AA	+/+
COMT H62H	rs4633	TT	+/+
COMT P199P	rs769224	GG	-/-
VDR Bsm	rs1544410	CC	-/-
VDR Taq	rs731236	__	no call
MAO-A R297R	rs6323	TT	+/+
ACAT1-02	rs3741049	AG	+/-
MTHFR C677T	rs1801133	GG	-/-
MTHFR 03 P39P	rs2066470	AG	+/-
MTHFR A1298C	rs1801131	GG	+/+
MTR A2756G	rs1805087	AA	-/-
MTRR A66G	rs1801394	GG	+/+
MTRR H595Y	rs10380	CC	-/-
MTRR K350A	rs162036	AA	-/-
MTRR R415T	rs2287780	CC	-/-
MTRR A664A	rs1802059	AG	+/-
BHMT-02	rs567754	CC	-/-
BHMT-04	rs617219	AA	-/-
BHMT-08	rs651852	__	no call
AHCY-01	rs819147	__	no call
AHCY-02	rs819134	__	no call
AHCY-19	rs819171	__	no call
CBS C699T	rs234706	GG	-/-
CBS A360A	rs1801181	__	no call
CBS N212N	rs2298758	__	no call
SHMT1 C1420T	rs1979277	__	no call

Несмотря на то, что на выходе клиент получает  готовый частный отчет по тесту Яско, медико-биологическая интерпретация результатов не так уж и проста, и требует определенной интеллектуальной сноровки и общегенетической эрудиции в плане понимания того, какую функцию выполняет тот или иной ген. Строго говоря, при грамотной интерпретации этих результатов, можно самостоятельно составить себе диету из витаминов-пищевых добавок, которые позволяет компенсировать обусловленный генетическим дисбалансом дефицит тех или иных энзимов.Примерный образец интерпретации можно посмотреть здесь

 

 

Древние геномы человека в перспективе генетического разнообразия современных популяций

Примерно месяц тому назад, один из замечательных представителей «гражданской науки» в области генетики, известный геномный блоггер Polako (Давид Веселовски) разместил в своем блоге заметку, в которой были приведены результаты самостоятельного изучения вариативности снип-мутаций в пяти наиболее известных  из отсеквенированных геномов древних людей.  Хотя, как мне представляется, основное внимание Давид уделил все же прояснению ответа на вопрос о расположении  древнего генома сибирского мальчика со стоянки Malta (13 тысяч снипов-вариантов в аутосомах) в пространстве главных компонентов генетического разнообразия (PCA) cовременных человеческих популяций. К слову, этот же образец (Malta-1) был на днях включен в новую таблицу откалиброванных процентных соотношений 13 конвенциональных генетических компонентов в популярном среди пользователей Gedmatch этно-популяционногенетическом калькуляторе Eurogenes K=13 .  Наряду с вышеназванным образцом, в отреферированном анализе использовались геномные снип-варианты древнего ДНК австралийского аборигена (46 тыс.снипов), Anzick-1 генома древнего индейца культуры Кловис (106 тыс.снипов), генома древнего экскимоса Saqqaq (68 тыс.снипов), геном обитателя мезолитической Испании La-Brana 1 (23 тыс.снипов).

Можно предположить, что при проведении статистических анализов PCA, Давид использовал в качества сравнительного эталона-референса известный график из статьи Lazaridis et al. 2013.

PCA из статьи-препринта Lazaridis et. al .2013.

К сожалению ,  Давид из Eurogenes по определенным причинам не включил в свой анализ варианты снипов остальных известных евразийских древних геномов задействованных в PCA-анализе статьи-препринта Lazaridis et al. 2013, в частности древние геномы неолитического периода — женщин  культур воронковидных кубков (Swedish_farmer) и культуры линейно-ленточной керамики Южной Германии (Stuttgart), а также неолитического жителя Тирольских Альп — Этци (Iceman). Нет в  анализе Давида и образцов мезолитического и эпинеолитического генофонда Европы — мезолитических охотников-собирателей Motala  и Losсhbour и неолитических охотников с острова Готланд (Skoglund_merge). C другой стороны, в широко обсуждаемой предварительной версии статьи Лазаридиса к анализу привлечены только актуальные в евразийской перспективе образцы, и поэтому на графике PCA отсутствуют геномы древнего аборигена Австралии и двух древних геномов из Северной Америки.

Я решил исправить эти недочеты за счет сведения всех древних геномов в единый график, увязав все эти геномы с древними популяциями предков современных этно-популяционных групп.  Принципы анализа были относительно просты, окончательная выборка популяций  была получена путем полуавтономного процесса слияния разных источников данных.  Отсеве снипов у представителей популяций в окончательной выборке был минимальный — использовались только модификаторы фильтра MAF (частота минорных аллелей) и HWE (пороговый критерий качества снипов с точки зрения закона равновесия Харди-Вайнберга).  Пороговое значение фильтр качества снипов по генотипированию я специально  оставил слегка заниженным, так как снипы отбирались по низкому значению коэффицента попарного сцепления в неравновесном наследовании.

Ниже в таблице приведены сводные данные о древних геномах и размерности числа снипов  этих образцов, которые использовались в моем анализе

Аncient (Afontova Gora) 10965

Australian Aborigen 236880

Otzi_Tyrolean 171195

Swedish_merged_farmer 1600

Swedish_merged_HG 4053

La Brana  57050

Malta-1 44459

LBK_Stuttgart 54220

Motala12 54677

Loschbour 54591

Motala_merged 35010

Визуализация двух первых главных компонентов разнообразия в популяциях выборки

В качестве программного обеспечения для проведения эксперимента с PCA, я использовал имплементацию PCA в новой версии программы plink. Эта имплементация уступает в точности вычислений классической программе Eigenstrat, однако заметно опережает в скорости, особенно на больших массивах данных.

Ниже я разместил серию визуализаций графика PCA. Первая иллюстрация — визуализация двух первых главных компонентов разнообразия, ставшая уже классической форма V-образного клина.

Из-за высокой плотности точек на графике, первая иллюстрация сложна для чтения. Поэтому  вместо того, чтобы наносить названия точек на график, я рассчитал центроиды точек популяций и разместил их на графике вместе с названием популяции.

Центроиды популяций

 Как видно из второго графика, мировый популяции равномерно распределились по углам триангуляции. Африканские популяции длинным шлейфом-вектором  от пигмеев до фулани, cахарцев и эфиопских этносов распредились в левой части V-клина. Между ними и европейцами находится большая группа смешанных рассовых групп — пуэрто-риканцы, доминиканцы, афроамериканцы Карибского региона и Северной Америки, морокканцы, мозабиты и жители Туниса. В вершине угла V клина находятся все классические европейские этнические группы и народности. Они образуют внутренний европейский градиент генетической вариативности, уменьшающийся по мере удаления на север.  Северные популяции европейцев (особенно в Скандинавии и Прибалтике) смыкаются с находящимися на самой веришине угла древними геномами европейцев времен мезолита (Motala, Loschbour, La Brana,и перехода к неолита. Эта картина соответствует тому, что мы наблюдаем на графике Lazaridis et al. 2013.  Наблюдаемая на моем графике более значительная дистанция шведских охотников-собирателей шведской культуры ямочной керамики от современных популяций северной Европы объясняется только тем, что в работе Lazaridis et al. 2013 использовалась большее количество тех снипов древних геномов, которые встречаются и в современных популяциях (т.е находятся в пределах современной вариативности генов жителей современной северной Европы). Поэтому дистанция в узказанной работе между древними и современными популяцими ниже (тот же феномен наблюдается и в неолитическом векторе). Неолитический «вектор» представлен шведским неолитическим фермером, Этци Тирольцем, женщиной из неолитического поселения возле современного Штуттгарта. Из современных популяций к этому вектору находятся близко сардинцы и баски.
 

Однако наиболее интересная картина наблюдается в правой части графика, где мы наблюдаем наложение сразу нескольких клинов-градиентов разнообразия. Наиболее сложная структура наблюдается в том месте правого «крыла» графика, куда проецируются геномы двух палеолитических жителей Сибири (Malta-1 и AG). В этом месте график начинает ветвиться на три тесно переплетенные вектора-градиенты. Один уходит через Средную Азию-Непал-Северную Индию на юг, где встречается в двигающимся ему навстречу вектору-градиенту представленному австралийскими аборигенами, онге, папуасами, меланизийцами, андаманцами и дравидами.  Второй вектор ведет через Алтай-Монголию и Китай в Индокитай и юго-восточную Азию.

Третий вектор разделяется сразу на две части — одна ведет к палеосибирским народами и далее к алеутам и экскимосам. Этот вектор заканчивается древним геномом Saqqaq, который видимо является самым чистым «образчиком» генома древних людей, связанных с этими группами. Второй уходит через группу североамериканских индейских народов на юг, в Мезоамерику и далее к индейцам южной Америки. Вектор заканчивается на Anzick-1, и — по аналогии c Saqqaq, — можно сделать вывод о том, что этот геном является квинтэссенцией «чистого америндского компонента» без позднейших вкраплений в ходе контактов с европейцами.

Примечательно, что эти вектора переплетены между собой настолько, что в 2-мерном пространстве первых двух компонент, чукчи и коряки, североамериканские индейцы и экскимосы, кхмеры и индусы оказываются рядом. Очевидно, что эта иллюзия. С целью доказать это  утверждения, я построил трехмерную визуализацию положения центроидов популяций в пространстве первых трех главных компонентов генетического разнообразия.

Трехмерная перспектива PCA

Молекулярная патология

Программные положения

«Традиционная патология занимается морфологическими проявлениями болезней. В дополнение к этому, молекулярная патология включает в себя приборы молекулярной биологии для того, чтобы изолировать и идентифицировать возбудители инфекционных заболеваний, понять роль дифференциальной экспрессии генов в этиологии болезни, предоставить более точные средства для диагностики заболеваний и обеспечить более индивидуализированный подход к терапии.

Многие болезни вызываются наследственными генными мутациями, например, муковисцидоз, мышечная дистрофия и лизосомные болезни накопления (в группу лизосомных болезней накопления (ЛБН) входят 50 — 70 различных редких генетических заболеваний). Другие изменения генов определяют бóльшую предрасположенность организма к заболеваниям, например, раку или болезням сердца.

Ключевыми методами молекулярной патологии для идентификации взаимосвязи между изменениями генов и заболеваниями являются выделение и культивирование клеток, иммуногистохимия, метод FISH и методы лабораторной молекулярной биологии (идентификация генных мутаций, определение профиля экспрессии, анализ белков, блоттинг, микрочипы).

Считается, что развитие злокачественных заболеваний проходит через определенные стадии, такие как гиперплазия, дисплазия, преинвазивный рак, инвазивная карцинома и метастазы, каждая из которых может быть связана с мутациями и изменениями экспрессии подгруппы генов. Лазерная микродиссекция с успехом применяется для выделения отдельных клеток или популяций клеток из ткани (замороженных, зафиксированных срезов тканей и монослоев культур клеток) для последующего генетического анализа, который обеспечивает возможность непосредственного сравнения нуклеиновых кислот клеток на различных стадиях развития болезни.

Влияние изменений генов на функцию белков и на заболевание можно исследовать с помощью различных методов наблюдения. Особенно важными являются такие методы, как наблюдение белок-белковых взаимодействий с помощью метода получения изображений в заданный промежуток времени, микроскопии TIRF и конфокальной флуоресцентной микроскопии, например трехмерный рендеринг и FRET/BRET. Они позволяют проводить пространственный и временной анализ динамических событий, включая, например, рецепторные взаимодействия и другие сигнальные события.»