Формальный анализ смешивания предковых популяций: белорусы, часть 2

Итак, после определения значимых для формального статистического моделирования комбинаций предковых популяций (или вернее, их суррогатов) представляется возможным смоделировать две вещи. Во-первых, необходимое с точки зрения статистики, число «импульсов» или «потоков» смешивания, а во-вторых, пропорции вклада «предковых» групп в генофонд белорусов.

Результаты анализа в программах qp3Pop и qpDstat показали, что в референтной группы белорусов присутствуют сигналы смешивания трех групп — мезолитических охотников-собирателей Европы (WHG), неолитических популяций земледельцев с Ближнего Востока и cибирских охотников-собирателей (чьи потомки в составе индоевропейцев) распространили свои гены по всей Европе.

Но меня больше интересует вопрос оценки величины доли вклада так называемого «базального компонента»(Basal Eurasian):

«четвертый элемент» — тот «базальный» компонент генофонда Европы, который проявился при моделировании истории сложения генофонда Европы в работе [Lazaridis et al., 2014] (см. раздел 8.4, рис 8.20) — предковой евразийской группой, которая внесла свой большой вклад и в геном неолитических земледельцев. Из аналогичной по методам модели, созданной в рассматриваемой работе [Seguin-Orlando et al., 2014], следует (рис. 8.6), что в геном человека из Костенок эти таинственные «базальные евразийцы» внесли не менее важный вклад, чем и верхнепалеолитические западные евразийцы. Также из модели следует, что он имел и общих, хотя и более отдаленных предков с древними северными евразийцами восточного ствола.

В этих целях я решил использовать в качестве суррогата базального евразийского генома геном Mota (древнего жителя Африки), примерно половину генома которого составлял тот самый пресловутый базальный компонент (результат обратных миграций натуфийского населния Ближнего Востока в восточную Африки)

Итак, в начале используем программу qpWave из того же пакета Admixtools

parameter file: qpWave.par

THE INPUT PARAMETERS

##PARAMETER NAME: VALUE
indivname: data.ind
snpname: data.snp
genotypename: data.geno
popleft: left
popright: right
maxrank: 6

qp4wave2 version: 200

left pops:
Levant_N
Mota
WHG
EHG

right pops:
Han
Onge
Papuan
Kostenki14
Ust_Ishim
Siberian_Upper_Paleolithic

0 Levant_N 13
1 Mota 1
2 WHG 2
3 EHG 3
4 Han 33
5 Onge 15
6 Papuan 14
7 Kostenki14 1
8 Ust_Ishim 1
9 Siberian_Upper_Paleolithic 1
jackknife block size: 0.050
snps: 572603 indivs: 84
number of blocks for block jackknife: 719
dof (jackknife): 631.955
numsnps used: 177238
f4info:
f4rank: 0 dof: 15 chisq: 574.447 tail: 9.47752373e-113 dofdiff: 0 chisqdiff: 0.000 taildiff: 1

<cf4info:
f4rank: 1 dof: 8 chisq: 115.553 tail: 2.7408605e-21 dofdiff: 7 chisqdiff: 458.894 taildiff: 5.4614954e-95
B:
scale 1.000
Onge -0.475
Papuan -0.521
Kostenki14 0.069
Ust_Ishim -0.746
Siberian_Upper_Paleolithic 1.986
A:
scale 290.851
Mota -0.932
WHG 0.299
EHG 1.429

f4info:
f4rank: 2 dof: 3 chisq: 8.502 tail: 0.036691843 dofdiff: 5 chisqdiff: 107.050 taildiff: 1.7204978e-21
B:
scale 1.000 1.000
Onge -0.462 -0.050
Papuan -0.522 -0.105
Kostenki14 0.288 2.189
Ust_Ishim -0.733 0.378
Siberian_Upper_Paleolithic 1.973 -0.232
A:
scale 286.604 578.115
Mota -0.951 -1.197
WHG 0.385 0.752
EHG 1.396 -1.001

f4info:
f4rank: 3 dof: 0 chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 8.502 taildiff: 0.036691843
B:
scale 1.000 1.000 1.000
Onge -0.400 -0.203 1.065
Papuan -0.459 -0.258 0.882
Kostenki14 0.299 2.175 0.273
Ust_Ishim -0.645 0.116 1.513
Siberian_Upper_Paleolithic 2.031 -0.382 0.850
A:
scale 282.949 595.536 1395.824
Mota -0.857 -1.172 0.944
WHG 0.466 0.827 1.449
EHG 1.431 -0.971 0.093

## end of run

Нас интересует статистика f4rank 2, и как видно она убедительна: chisq: 8.502 tail: 0.036691843 dofdiff: 5 chisqdiff: 107.050 taildiff: 1.7204978e-21.  То есть, для моделирования референсной популяции достаточно трех «источников» (в f4rank 3, т.е с 4 предковыми популяциями, статистика гораздо хуже: chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 8.502 taildiff: 0.036691843 ).

Следующим этапом будет оценка пропорций «адмикса», образованного смешением трех «источников»:

 

parameter file: qpAdm.par

THE INPUT PARAMETERS

##PARAMETER NAME: VALUE
genotypename: data.geno
snpname: data.snp
indivname: data.ind
popleft: left
popright: right
maxrank: 8

qpAdm version: 200

left pops:
Belarusian
Mota
WHG
EHG
right pops:
Han
Onge
Papuan
Kostenki14
Ust_Ishim
Siberian_Upper_Paleolithic
0 Belarusian 25
1 Mota 1
2 WHG 2
3 EHG 3
4 Han 33
5 Onge 15
6 Papuan 14
7 Kostenki14 1
8 Ust_Ishim 1
9 Siberian_Upper_Paleolithic 1
jackknife block size: 0.050
snps: 572603 indivs: 96
number of blocks for block jackknife: 719
dof (jackknife): 628.796
numsnps used: 227599
codimension 1
f4info:
f4rank: 2 dof: 3 chisq: 20.724 tail: 0.000120097824 dofdiff: 5 chisqdiff: -20.724 taildiff: 1
B:
scale 1.000 1.000
Onge -0.502 0.176
Papuan -0.562 0.218
Kostenki14 0.442 2.074
Ust_Ishim -0.735 0.779
Siberian_Upper_Paleolithic 1.923 -0.110
A:
scale 285.645 552.926
Mota -1.490 -0.238
WHG 0.017 1.685
EHG 0.883 -0.324
full rank 1
f4info:
f4rank: 3 dof: 0 chisq: 0.000 tail: 1 dofdiff: 3 chisqdiff: 20.724 taildiff: 0.000120097824
B:
scale 1.000 1.000 1.000
Onge -0.502 0.178 0.403
Papuan -0.599 0.280 0.995
Kostenki14 0.455 2.029 -0.773
Ust_Ishim -0.773 0.879 1.373
Siberian_Upper_Paleolithic 1.893 0.008 1.168
A:
scale 288.199 555.700 1346.772
Mota -1.449 -0.056 0.947
WHG 0.026 1.726 0.141
EHG 0.948 -0.132 1.444
best coefficients: 0.318 0.148 0.534
ssres:
0.000295769 0.000789821 0.000059100 0.001247609 0.001271289
0.335431254 0.895733409 0.067025433 1.414909018 1.441765444
Jackknife mean: 0.316895017 0.150748678 0.532356305
std. errors: 0.035 0.067 0.045
error covariance (* 1000000)
1212 -1838 625
-1838 4506 -2668
625 -2668 2043
fixed pat wt dof chisq tail prob
000 0 3 20.724 0.000120098 0.318 0.148 0.534
001 1 4 125.483 0 -0.088 1.088 0.000 infeasible
010 1 4 25.750 3.55457e-05 0.378 0.000 0.622
100 1 4 102.973 2.28952e-21 0.000 0.702 0.298
011 2 5 336.445 0 1.000 0.000 0.000
101 2 5 127.950 6.47788e-26 0.000 1.000 0.000
110 2 5 184.757 0 0.000 -0.000 1.000
best pat: 000 0.000120098 - -
best pat: 010 3.55457e-05 chi(nested): 5.025 p-value for nested model: 0.0249831
best pat: 101 6.47788e-26 chi(nested): 102.201 p-value for nested model: 5.01661e-24

end of run

Итак, лучшими коэффициентам (пропорциями адмикса) являются 0.318 0.148 0.534. То есть референсная популяция белорусов может быть смоделирована как 30 % базального компонента, 15% компонента мезолитических охотников собирателей и 53% компонента жителей степи бронзового века («индоевропейцев»). Очевидно, что большая часть базального компонента попала в Европу вместе неолитическими земледельцами, а оставшаяся часть — была принесена индоевропейцами.

 

Геномика датской популяции

В середине августа в журнале Genetics опубликовали статью о генофонде современной датской популяции Athanasiadis et al., Nationwide Genomic Study in Denmark Reveals Remarkable Population Homogeneity, Genetics Early online August 17, 2016; DOI: 10.1534/genetics.116.189241

Методологически исследование напоминает известную статью о генофонде Великобритании.

Аннотация: Дания играет существенную роль в истории Северной Европы. В рамках общенациональной научной просветительской инициативы, мы собрали генетические и антропометрические данные примерно 800 датчан — учащихся средней школы и использовали их, чтобы выяснить генетический состав населения Дании, а также для оценки методики полигенного предсказания фенотипических признаков у подростков. Мы обнаружили замечательную однородность датского генофонда в разных географических регионах, хотя  исследование и  обнаружило слабые сигналы генетической структуры, отражающие историю страны. Датский генофонд характеризуется геномной близостью с соседними странами, особенно общим сходством по генетическим маркерам снижения веса из Великобритании, Швеции, Норвегии, Германии и Франции. Геномный сигнал обмена генами с польской популяцией был обнаружен в регионах Зеландия и Фюна , причем наша датировка даты «смешения» совпала с историческими свидетельствами о переселении славян-вендов на юге Дании. Мы также обнаружили  значительное различие в демографической истории скандинавских стран. Дания имеет наименьший текущий эффективный размер популяции по сравнению с Норвегией и Швецией. И, наконец, мы обнаружили, что полигенное предсказание самооценки роста у подростков  в датской популяции был удивительно точным (коэффициент корреляции R2 = 0,639 ± 0,015). Высокая однородность генофонда населения Дании позволят пренебречь изучением этнической структуры генофонда  в ходе предстоящих крупномасштабных исследований по картированию генов (GWAS) в  стране.

Анализ древней ДНК – проблемы, их преодоление и результаты

На портале Генофонд.ру размещен реферат важной статьи, подводящей промежуточные итоги изучения древней ДНК. Я позволю себе удовольствие процитировать себе некоторые места этого замечательного обзора, написанного ув. Надеждой Марковой

Термин «древняя ДНК» возник в научной литературе в 1980-х годах в связи с появлением новой области исследований, которая получила название «молекулярная палеонтология». С развитием сначала методов ДНК-амплификации (полимеразной цепной реакции), а потом методов секвенирования нового поколения эта область получила мощный толчок к развитию и сегодня стала основным средством реконструкции эволюции живых организмов, и в том числе реконструкции истории человека.

Революция в эволюционной генетике

Исследование древней ДНК совершило революцию в эволюционной генетике, так как появилась возможность напрямую исследовать прошлое, законсервированное в «капсуле времени» ДНК, пишут авторы статьи. Работы последних десятилетий показали, что древняя ДНК может сохраняться в костях, зубах, мумифицированных и замороженных тканях, и может быть извлечена из этих древних образцов. Впервые древняя ДНК была извлечена в 1984 г. (Higuchi et al.) из высохшей мышцы вымершего родственника зебры. Но ее анализ целиком зависел от развития технологий, поэтому стал возможен с появлением ДНК-амплификации (метод полимеразно-цепной реакции – ПЦР), и вышел на новый уровень с появлением методов секвенирования нового поколения. На рисунке авторы представили основные вехи в истории изучения древней ДНК.

О методологии исследования палео-ДНК

Методы палеогенетики оказались незаменимы, чтобы разобраться в  ключевых этапах человеческой цивилизации. Например, понять, как именно происходила смена обществ охотников-собирателей на первых земледельцев, как распространялось по Европе сельское хозяйство – имела ли место передача технологий от одних популяций другим или же происходила смена самих популяций («циркуляция идей или людей»). Анализ древней ДНК показал, что между периодами 8 и 5 тысяч лет назад Европа не была генетически однородной: первые земледельцы с Ближнего Востока мигрировали в Западную Европу и  смешивались там с местными охотниками-собирателями. В Восточную Европу около  6-5 тыс. лет назад туда пришли группы людей из Анатолии, которые смешавшись с охотниками-собирателями, дали начало популяциям скотоводов, наиболее успешная из которых известна по ямной культуре.  Полагают, что именно миграции ямников из понто-каспийских степей на запад и на восток около 4,5 тыс. лет назад можно связать с распространением технологий и, возможно, языков индоевропейской семьи.

Древняя ДНК может помочь и в изучении развития признаков, характерных только для Homosapiens, таких как речь, подчеркивают авторы статьи. Изучение генетических вариаций, связанных с языком, дает информацию о том, когда мог возникнуть сложный  язык, присущий человеку. Так, было показано, что определенный вариант гена FOXP2 (именно его в первую очередь связывают с развитием речи)  имелся уже у неандертальцев. Вероятно, считают специалисты, этот вариант возник у общих предков неандертальцев и современного человека.

Древняя ДНК помогает в изучении адаптации человека к разным условиям среды. При анализе древних геномов в них были выявлены сигналы отбора, связанных с изменением диеты, чувствительностью к ультрафиолету  и пр. Так, становится ясно, как распространялись по Европе такие черты, как светлая кожа и толерантность  к лактозе (способность переваривать молоко во взрослом возрасте).

Трудности в изучении палео-ДНК и их преодоление

Одна из основных проблем, с которыми сталкиваются исследователи древней ДНК, это ее деградация, которая неизбежно происходит со временем.  Обычно ДНК из древних образцов сильно фрагментирована, загрязнена микробной ДНК и химически модифицирована. Причем степень деградации  в больше степени зависит от условий, в которых находился древних образец (температура, влажность), чем от его возраста. Последние исследования показали, что теоретический предел возраста образца, из которого можно извлечь ДНК, составляет 1-1,5 млн лет. Авторы описывают методы, которыми можно преодолеть трудности, связанные с особенностями древней ДНК.

Фрагментация ДНК может быть частично преодолена с помощью современных протоколов, позволяющих извлекать и анализировать очень короткие фрагменты, длиной 50-70 нуклеотидов. К тому же, методы секвенирования нового поколения ориентированы на анализ коротких фрагментов, длина которых составляет 50-100 нуклеотидов.

Большую проблему составляет контаминация древней ДНК современной ДНК. Преодолеть ее нужно путем строгого соблюдения протоколов, учитывающих правила сбора образов, обработки рабочих помещений, применение методов ДНК-аутентификации, независимой перепроверки результатов и пр. Развиваются также методы механической и химической деконтаминации – авторы их описывают.

Еще одна важная проблема – посмертное изменение ДНК из-за гидролиза и окисления, вызывающее деаминацию нуклеотидов, которая ведет к ложным результатам ПЦР. Авторы описывают несколько молекулярно-генетических и биоинформатичесих подходов для преодоления этой проблемы, с ними можно ознакомиться в тексте статьи.

Инструменты анализа

С увеличением числа образцов древней ДНК ученые получают возможность исследовать древнюю генетическую изменчивость на популяционном уровне и сравнивать ее с современной. Различные методы (PCA, STRUCTURE, ADMIXTURE, SPAMIX, SPA, ADMIXTOOLS, GPS, LAMP, HAPMIX,  reAdmix, MUTLIMIX, mSpectrum, SABER и др.), которые были разработаны для анализа современных популяций, применяются и к древним популяциям. В комбинации с антропологическими данными и историческими  сведениями они позволяют реконструировать пути миграций, определять состав предков той или иной популяции, выяснять географическое  происхождение гаплотипов.

Эпигенетика и палео-ДНК

Фенотипическое проявление генотипической изменчивости зависит не только от изменчивости тех или иных аллелей в геноме, но и от степени экспрессии генов, а она во многом определяется химическими модификациями, не затрагивающими последовательность нуклеотидов в ДНК, то есть эпигенетическими. Это метилирование ДНК, модификация белков-гистонов, спектр некодирующей РНК. Последние исследования показали, что некоторые эпигенетические модификации сохраняются и postmortem. Так, удалось картировать метилирование генома неандертальцев и денисовцев. Выяснилось, что некоторые гены были более метилированы у древних людей, чем у современных. Анализ метилирования позволяет также определить возраст индивида (как современного – что важно для криминалистики, так и древнего).

Новая программа для анализа субструктуры популяции

На ресурсе Bioarxiv опубликован препринт статьи, описывающей новую программу для анализа предковых компонентов в изучаемых геномах.  Программа называется Ohana (Linuxовские исходники доступны на Github).

Программа представляет собой дальнейшее развитие парадигмы, использованной при создании программ подобного рода, в том числе и популярных Admixture/STRUCTURE.

Что же именно представляет собой программа Ohana:

Мотивация:  методы выявления генетической cтруктуры популяции часто используются в процентной классификации (доли различных компонентов происхождения) отдельных образцов (геномов) в выборке популяции.
Вклад: Мы вводим новый алгоритм оптимизации классической модели структуры в рамках максимального  правдоподобия. Используя анализ реальных данных, мы показываем, что новый алгоритм оптимизации находит более высокие значения оценки правдоподобия, в сравнении с стандартными методами,   за то же самое время вычислений. Мы также представляем новый метод оценки деревьев популяций предковых компонентов с использованием гауссовой аппроксимации. Используя модель коалесценции популяций,  мы моделируем  эволюцию популяций в виде дерева, а затем исследуем адекватность модели структуры и гауссовской аппроксимации в  правильной идентификации предковых  компонентов родословной и вывода правильной типологии дерева популяций. В большинстве случаев предковые компоненты выводятся правильно, хотя очевидно, что  размер выборки и количество времени, прошедшего с момента смешивания предковых компонентов могут влиять на статистическую достоверность выводов. Вместе с этим, популярная гауссовская аппроксимация  работает гораздо хуже в случае с длинными ветвями популяционного дерева, хотя сама топология дерева была определена правильно во всех рассматриваемых сценариях. Новые методы реализованы средствами языка C++  вместе с соответствующими средствами визуализации в программном пакете Ohana.

Судя по описанию, метод явно продвинут в сравнении с Admixture, и поэтому я решил протестировать программу на своих данных. Поскольку задачей опыта являлась только проверка быстродействия и эффективности программы, я ограничился лишь малым числом снипов (около 1000 снипов) и небольшим числом итерационных шагов. Ниже таблица значений параметра максимальной правдоподобности для разных шагов:

step global-lle local-lle lle-ratio
21 -2.6833044517734939e+00 +2.2770091451382113e-01 +5.8220107325746300e+00
1 +5.7815216343991231e+00 +5.8036336413385650e+00 +4.4224013878883639e-02
7 -3.2739383333912819e-01 +2.2497694453045547e-01 +1.1047415557391673e+00
11 +9.0926715174206318e-01 +2.0066743030967706e+00 +2.1948143027094149e+00
3 +2.8748265011322980e+00 +2.9590787934518543e+00 +1.6850458463911266e-01
7 +8.4540873293179075e-01 +1.3498715551047624e+00 +1.0089256443459433e+00
37 -9.0929035297321050e+00 -2.4194504122282945e+00 +1.3346906235007621e+01
23 -6.4421783036780722e+00 -2.9697235103566051e+00 +6.9449095866429342e+00
0 +9.1345873004805362e+00 +9.1345873004805362e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.4695915386474794e+00 +3.4695915386474794e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.3865281380151862e+00 -1.8991488640961749e+00 +4.9747585478380225e+00
4 +1.0433650310897962e+00 +1.2522823332105344e+00 +4.1783460424147645e-01
3 +3.8995915259094627e-01 +5.1634020990696783e-01 +2.5276211463204312e-01
15 -2.6434691070829723e+00 -9.1086633128607586e-01 +3.4652055515937930e+00
23 -6.2198104594655677e+00 -2.8358886349280032e+00 +6.7678436490751288e+00
38 -9.2321798956810461e+00 -2.4916759096277969e+00 +1.3481007972106498e+01
18 -3.0934554567431443e+00 -8.3611477310109894e-01 +4.5146813672840906e+00
8 -2.9282539314651679e-01 +3.5738671950948531e-01 +1.3004242253120042e+00
0 +1.2524391609263201e+00 +1.2524391609263201e+00 +0.0000000000000000e+00
23 -6.3837385390039652e+00 -2.9271554091217755e+00 +6.9131662597643793e+00
2 +4.7424981408020610e+00 +4.7836466971388827e+00 +8.2297112673643369e-02
38 -9.2130245369173807e+00 -2.3278870997257695e+00 +1.3770274874383222e+01
1 +2.1840574314321817e+00 +2.1865405531001443e+00 +4.9662433359252134e-03
41 -1.1365527747446823e+01 -3.8377028622021787e+00 +1.5055649770489289e+01
19 -4.6712611393212642e+00 -2.1928314855773308e+00 +4.9568593074878669e+00
6 +1.3815323261198040e+00 +1.8025611535312844e+00 +8.4205765482296080e-01
23 -4.9303692315665009e+00 -1.5318143061696987e+00 +6.7971098507936043e+00
0 +8.7328319984824621e+00 +8.7328319984824621e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.6224582165934160e+00 -1.4932121483648810e+00 +4.2584921364570700e+00
3 +6.2377234983784291e-01 +7.6110530798112475e-01 +2.7466591628656367e-01
0 +2.8587282041554891e+00 +2.8587282041554891e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.0021218825872920e+00 +1.4509671718689843e-01 +4.2944371995483808e+00
17 -7.4762584701409729e-01 +1.3932955886732108e+00 +4.2818428713746162e+00
23 -6.0653903327212779e+00 -2.6838881450153060e+00 +6.7630043754119438e+00
37 -1.0579776808339723e+01 -3.8892391993640034e+00 +1.3381075217951439e+01
26 -7.2335181019782047e+00 -3.1331829046686970e+00 +8.2006703946190154e+00
7 +1.6176269530996734e+00 +2.1323381483718942e+00 +1.0294223905444415e+00
33 -9.4030285154229958e+00 -3.6623273360729955e+00 +1.1481402358700000e+01
17 -2.6786343483216859e+00 -4.8812953327852648e-01 +4.3810096300863188e+00
23 -6.2058034431150313e+00 -2.8516189784547787e+00 +6.7083689293205051e+00
67 -1.6909072528028993e+01 -2.3911037254752712e+00 +2.9035937605107442e+01
23 -6.3833745927401013e+00 -2.9452455097675125e+00 +6.8762581659451776e+00
6 -6.8296012812943019e-01 -2.9942977621450506e-01 +7.6706070382985025e-01
10 -9.8126315419471322e-01 -2.3661063865609844e-02 +1.9152041806582067e+00
0 +5.7982106350815634e+00 +5.7982106350815634e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -1.3501638874870379e+00 -3.2011308106384817e-01 +2.0601016128463794e+00
43 -1.2192493550573289e+01 -4.1196420795722730e+00 +1.6145702942002032e+01
9 -1.2593028903325809e+00 -4.3270295902646971e-01 +1.6531998626122224e+00
26 -6.2578642716373176e+00 -2.2062845684156107e+00 +8.1031594064434138e+00
18 -4.6071642202381673e+00 -2.2886078113529225e+00 +4.6371128177704897e+00
10 -1.6054495070597854e+00 -6.2383936794881567e-01 +1.9632202782219395e+00
0 +5.9054976846801948e+00 +5.9054976846801948e+00 +0.0000000000000000e+00
28 -7.9544016666424726e+00 -3.4037434923762198e+00 +9.1013163485325066e+00
13 -2.9739447952442584e+00 -1.6013630431924359e+00 +2.7451635041036448e+00
4 +1.9967631453426975e+00 +2.2200585780891835e+00 +4.4659086549297200e-01
39 -1.0623165622856330e+01 -3.6098560664792703e+00 +1.4026619112754119e+01
4 +1.3492145910943503e+00 +1.5207738925609045e+00 +3.4311860293310836e-01
4 -4.8375924280681382e-02 +1.4610896360477543e-01 +3.8896977577091363e-01
7 +8.1849987178406280e-01 +1.2983567287204032e+00 +9.5971371387268078e-01
5 +1.6411578376630134e+00 +1.8879445182589061e+00 +4.9357336119178541e-01
20 -5.3566590509046721e+00 -2.5267308158062618e+00 +5.6598564701968206e+00
20 -3.7357745162316442e+00 -9.4441504240310703e-01 +5.5827189476570744e+00
0 +6.9003012244484054e+00 +6.9003012244484054e+00 +0.0000000000000000e+00
14 +1.0212512913520566e-01 +1.6552863620284790e+00 +3.1063224657865467e+00
14 -3.4484977966479979e+00 -1.8336229600851968e+00 +3.2297496731256023e+00
33 -8.5640317341738701e+00 -2.9981723641670950e+00 +1.1131718740013550e+01
0 +7.6321228134304206e+00 +7.6321228134304206e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.0411387531718366e+00 +3.0411387531718366e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.8803472670016577e+00 +3.8803472670016577e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +4.2070184059954663e-01 +1.6582565595913112e+00 +2.4751094379835292e+00
0 +9.4043783383643351e+00 +9.4043783383643351e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +3.9493772701791690e+00 +4.0401282575008803e+00 +1.8150197464342277e-01
7 -8.2136167712014529e-01 -3.6756700619833005e-01 +9.0758934184363049e-01
3 +1.2561184081287848e+00 +1.3862458241709996e+00 +2.6025483208442957e-01
46 -1.3514965313978369e+01 -4.6676326406095789e+00 +1.7694665346737580e+01
4 +2.3316433138862669e+00 +2.4883134289675559e+00 +3.1334023016257806e-01
15 -3.1749597466612700e+00 -1.4486952266745639e+00 +3.4525290399734123e+00
0 +3.6076601056818594e+00 +3.6076601056818594e+00 +0.0000000000000000e+00
6 -1.3547629288250551e-01 +2.0571844793874394e-01 +6.8238948164249891e-01
0 +3.3538897545168909e+00 +3.3538897545168909e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -6.6085068659091144e+00 -1.9851117443357860e+00 +9.2467902431466573e+00
6 -7.5147980093472455e-01 -3.9214478407419762e-01 +7.1867003372105387e-01
0 +3.9963783521703307e+00 +3.9963783521703307e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.2911893761129702e+00 +3.2911893761129702e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.2846786735668649e+00 -1.1408980141492142e+00 +4.2875613188353014e+00
14 -1.4178238173926916e+00 +1.2253279138372619e-01 +3.0807132175528356e+00
14 -3.3434887984775541e+00 -1.6779029394864886e+00 +3.3311717179821310e+00
0 +9.1572547755033096e+00 +9.1572547755033096e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.2626932054166078e+00 -3.5141586686062176e-01 +1.8225546771119721e+00
19 -1.8461856116383517e+00 +6.1853369726772289e-01 +4.9294386178121492e+00
8 -1.0410086051735501e+00 -3.4965278679539402e-01 +1.3827116367563121e+00
31 -6.5429305189645044e+00 -1.4024683499866222e+00 +1.0280924337955764e+01
1 +1.2012483311196434e+00 +1.2246107704918217e+00 +4.6724878744356602e-02
27 -6.3263423782410699e+00 -2.0387502987785164e+00 +8.5751841589251079e+00
0 +3.4752054267394046e+00 +3.4752054267394046e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.3260016674493693e+00 -1.6641525377097302e+00 +3.3236982594792783e+00
2 +4.6391346051693745e+00 +4.7074159854863442e+00 +1.3656276063393946e-01
18 -1.7655900381188054e+00 +5.6763635576112303e-01 +4.6664527877598569e+00
5 +2.6107959381474792e+00 +2.9007775105489291e+00 +5.7996314480289968e-01
5 +2.1843942491619988e+00 +2.4627753404760413e+00 +5.5676218262808508e-01
0 +3.6852550999196674e+00 +3.6852550999196674e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +2.2205561518413388e+00 +3.0234170340292152e+00 +1.6057217643757529e+00
6 +1.3664382420077841e+00 +1.6966274552596250e+00 +6.6037842650368184e-01
19 -4.4023423595988431e+00 -1.8800350949122522e+00 +5.0446145293731819e+00
0 +3.8688677137151655e+00 +3.8688677137151655e+00 +0.0000000000000000e+00
73 -2.0949919293569959e+01 -4.7907197907594652e+00 +3.2318399005620989e+01
1 +3.5554293807950907e+00 +3.5653571640236477e+00 +1.9855566457113838e-02
61 -1.7504913653374910e+01 -4.7134638568973735e+00 +2.5582899592955073e+01
15 -2.3496916597601460e+00 -6.1989728884619355e-01 +3.4595887418279050e+00
9 -1.1124922469964771e+00 -3.9306629177513219e-01 +1.4388519104426898e+00
40 -1.0130420397429226e+01 -2.7600791428097899e+00 +1.4740682509238873e+01
28 -6.2646417800198462e+00 -1.8712309259120481e+00 +8.7868217082155962e+00
30 -8.2940098011971699e+00 -3.2575093442052663e+00 +1.0073000913983808e+01
16 -3.9789358263553369e+00 -2.0447399120105771e+00 +3.8683918286895196e+00
24 -4.7319936861905374e+00 -1.2309206168595050e+00 +7.0021461386620647e+00
50 -1.4771830397990250e+01 -4.7468160179959664e+00 +2.0050028759988567e+01
66 -1.9775329423936054e+01 -5.7044932592467479e+00 +2.8141672329378611e+01
27 -6.4821921796055166e+00 -2.3071428385722479e+00 +8.3500986820665375e+00
22 -6.0637478907011628e+00 -2.8387301708702379e+00 +6.4500354396618498e+00
19 -3.3145656028033086e+00 -8.2787439053755918e-01 +4.9733824245314988e+00
11 +1.8067628327733143e-01 +1.3070242269646046e+00 +2.2526958873745464e+00
0 +1.0664985244463050e+01 +1.0664985244463050e+01 +0.0000000000000000e+00
11 -7.5458750582718714e-01 +3.4696598960010006e-01 +2.2031069908545744e+00
0 +6.3845634692411757e+00 +6.3845634692411757e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +1.2253166144940426e+00 +1.7013611250364296e+00 +9.5208902108477389e-01
0 +2.2332252301150746e+00 +2.2332252301150746e+00 +0.0000000000000000e+00
31 -8.0519218099965713e+00 -2.9846513008391273e+00 +1.0134541018314888e+01
4 +2.4692778009043783e+00 +2.6471239053685025e+00 +3.5569220892824838e-01
6 +3.5474308704061017e+00 +3.9320576649321666e+00 +7.6925358905212970e-01
1 +7.6321929467552163e-01 +7.7371899642427522e-01 +2.0999403497507174e-02
20 -4.6091354660655464e+00 -1.8831451771238030e+00 +5.4519805778834867e+00
37 -1.0129886889420138e+01 -3.5049438312000651e+00 +1.3249886116440146e+01
9 -1.3478953370113151e+00 -6.1126866473294861e-01 +1.4732533445567331e+00
15 -3.5603325674454434e+00 -1.8336902540647766e+00 +3.4532846267613335e+00
23 -5.8756875138002860e+00 -2.4885147744651173e+00 +6.7743454786703374e+00
25 -5.2630197987481564e+00 -1.4901283126568581e+00 +7.5457829721825966e+00
22 -4.6505867423895806e+00 -1.5418656747224535e+00 +6.2174421353342542e+00
7 -5.9552142856104151e-01 -8.8676524949510060e-02 +1.0136898072230629e+00
61 -1.8469603264559318e+01 -5.5085368441738511e+00 +2.5922132840770935e+01
0 +6.5611806224091760e+00 +6.5611806224091760e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.2454424814746222e+01 -3.8756241090360741e+00 +1.7157601411420295e+01
2 +1.4936790971716833e+00 +1.5443157230138103e+00 +1.0127325168425383e-01
24 -4.9855905349318244e+00 -1.3691134474993452e+00 +7.2329541748649584e+00
0 +5.4059733116587152e+00 +5.4059733116587152e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -8.3287727010210553e+00 -3.5109736380446810e+00 +9.6355981259527486e+00
6 -9.0525257564573103e-01 -4.9035877015595108e-01 +8.2978761097955989e-01
8 -6.4300983752890950e-02 +6.2949995221823674e-01 +1.3876018719422554e+00
18 -1.6807476972921531e+00 +5.8624083453305964e-01 +4.5339770636504255e+00
1 +3.5721205803909095e+00 +3.5818192117155454e+00 +1.9397262649271774e-02
24 -6.1577637742262690e+00 -2.4834183189506129e+00 +7.3486909105513121e+00
27 -7.1496869791234205e+00 -2.9244287522105861e+00 +8.4505164538256690e+00
8 -5.6130490268747746e-01 +5.9960502445047581e-02 +1.2425308102650501e+00
22 -4.7031168681283519e+00 -1.4866179789189591e+00 +6.4329977784187857e+00
63 -1.9081574348421938e+01 -5.6305584192753786e+00 +2.6902031858293121e+01
7 +5.8016086062937777e-01 +1.0896938249318202e+00 +1.0190659286048849e+00
0 +1.0253545438881417e+01 +1.0253545438881417e+01 +0.0000000000000000e+00
5 +1.0871323777377295e-01 +3.6012080718820982e-01 +5.0281513882887374e-01
7 +3.5619491977679107e-01 +9.1621270316993719e-01 +1.1200355667862922e+00
0 +4.1014200837547570e+00 +4.1014200837547570e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -8.6873618265199930e+00 -2.6505171760394766e+00 +1.2073689300961032e+01
54 -1.6224994615039677e+01 -5.1746625676062212e+00 +2.2100664094866911e+01
18 -4.5215172544928395e+00 -2.2547668545408959e+00 +4.5335007999038872e+00
18 -3.0503700330491101e+00 -8.0720630674103289e-01 +4.4863274526161545e+00
5 +5.8582574879526561e-02 +3.6493540878393382e-01 +6.1270566780881452e-01
25 -6.9733140116971155e+00 -3.1034863034763469e+00 +7.7396554164415372e+00
15 -2.5025936523299910e+00 -6.9523024428651947e-01 +3.6147268160869430e+00
5 +8.0786088450220284e-01 +1.0851325629709074e+00 +5.5454335693740919e-01
0 +8.2691985451022951e+00 +8.2691985451022951e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.9439917368190862e+00 +8.9439917368190862e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -2.7701982669716685e-01 +8.3944868058894606e-01 +2.2329370145722258e+00
16 +1.6645420052293840e+00 +3.6132059006837456e+00 +3.8973277909087232e+00
17 -4.2279921819119410e+00 -2.1299991954245332e+00 +4.1959859729748157e+00
0 +5.4735579139588761e+00 +5.4735579139588761e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +5.2417101444202379e+00 +5.2417101444202379e+00 +0.0000000000000000e+00
10 +8.0610931785766571e-01 +1.7383915439886359e+00 +1.8645644522619405e+00
0 +6.5317507188945925e+00 +6.5317507188945925e+00 +0.0000000000000000e+00
99 -3.3176634407111457e+01 -6.2048925977727594e+00 +5.3943483618677398e+01
0 +9.2241116373635972e+00 +9.2241116373635972e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +7.0421664921981026e+00 +7.0421664921981026e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.2322421609594594e+00 -3.0907776287764221e-01 +1.8463287961636343e+00
15 -5.3961510722184336e-01 +1.2975139327884508e+00 +3.6742580800205884e+00
14 -2.9072386225207927e+00 -1.2692769639613632e+00 +3.2759233171188589e+00
28 -7.8564889853050071e+00 -3.3865507006528772e+00 +8.9398765693042606e+00
18 -3.6485330378701759e+00 -1.2474399791371424e+00 +4.8021861174660669e+00
7 -5.4955663167988700e-01 -9.6477835555973002e-02 +9.0615759224782799e-01
12 -4.5392808921571692e-01 +7.6793711457424907e-01 +2.4437304075799320e+00
40 -1.1517800488775020e+01 -4.2167799725608379e+00 +1.4602041032428364e+01
16 -3.9601734181906272e+00 -2.0652037591278667e+00 +3.7899393181255210e+00
54 -1.5250320335764563e+01 -4.4008431550872675e+00 +2.1698954361354591e+01
36 -1.0365917811914290e+01 -3.9422396480742119e+00 +1.2847356327680156e+01
1 +3.0986003703654137e+00 +3.1070907156615215e+00 +1.6980690592215630e-02
13 -1.6112672380173452e+00 -1.9937299450922330e-01 +2.8237884870162437e+00
0 +5.9327072336683333e+00 +5.9327072336683333e+00 +0.0000000000000000e+00
5 -1.1536342275959832e-01 +1.4957033405504294e-01 +5.2986751362928253e-01
0 +9.4473533195992498e+00 +9.4473533195992498e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +1.2298526077710132e+00 +1.7154178339471993e+00 +9.7113045235237205e-01
47 -1.2409792749027684e+01 -3.1737629860218575e+00 +1.8472059526011652e+01
29 -7.5360039561605019e+00 -2.8579502357819448e+00 +9.3561074407571141e+00
14 -6.9355418829951265e-01 +9.6648151950494299e-01 +3.3200714156089113e+00
16 -2.9490629426907615e+00 -1.0858325762519732e+00 +3.7264607328775767e+00
1 +1.4179200329325266e+00 +1.4221234178381739e+00 +8.4067698112946232e-03
37 -1.0702475234674058e+01 -3.9774630194365752e+00 +1.3450024430474965e+01
40 -1.1283161019960101e+01 -3.8012845123237775e+00 +1.4963753015272648e+01
0 +1.0122770861521364e+01 +1.0122770861521364e+01 +0.0000000000000000e+00
24 -1.9167801662675474e+00 +1.6864777352401115e+00 +7.2065158030153178e+00
0 +8.0608057827852768e+00 +8.0608057827852768e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.2852995772786366e+00 -1.9018654301170086e+00 +4.7668682943232561e+00
21 -3.2833633722164537e+00 -2.7099992758961822e-01 +6.0247268892536709e+00
2 +1.5012352645685096e+00 +1.5575394813161045e+00 +1.1260843349518979e-01
8 -1.2488053817540647e+00 -6.4812432294124900e-01 +1.2013621176256315e+00
32 -8.9595087221905487e+00 -3.6519922646765650e+00 +1.0615032915027967e+01
11 +1.2020524818013989e-01 +1.1669169510732664e+00 +2.0934234057862531e+00
33 -9.5395053219915944e+00 -3.8349505662896721e+00 +1.1409109511403845e+01
62 -1.8217802794875535e+01 -5.1828564290961063e+00 +2.6069892731558859e+01
9 +2.8918665079433659e-01 +9.9344885398075267e-01 +1.4085244063728322e+00
18 -4.5447745895626683e+00 -2.2385335689272328e+00 +4.6124820412708711e+00
6 -2.2522060068723082e-01 +1.3069529955327219e-01 +7.1183180048100603e-01
0 +6.2922155637704273e+00 +6.2922155637704273e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -3.0694598679607159e+00 -9.7517276423658839e-01 +4.1885742074482550e+00
40 -1.1630241794549921e+01 -4.2939068055100291e+00 +1.4672669978079783e+01
18 -4.1240492853488773e+00 -1.8385167691708197e+00 +4.5710650323561151e+00
16 -2.8989774748500574e+00 -8.9985404880907938e-01 +3.9982468520819561e+00
18 -4.6989974506312739e+00 -2.3570671893355630e+00 +4.6838605225914218e+00
0 +8.1543159398132392e+00 +8.1543159398132392e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -3.3574070342167124e+00 -9.9626228499164871e-01 +4.7222894984501274e+00
24 -5.1474780037766878e+00 -1.5349074255305504e+00 +7.2251411564922750e+00
12 -8.4223570570590578e-01 +3.2840701493665714e-01 +2.3412854412851258e+00
13 -2.3083667740166840e+00 -8.2479840457107700e-01 +2.9671367388912140e+00
18 -1.0630573703209274e+00 +1.3587895053515520e+00 +4.8436937513449587e+00
12 -5.7132264516139930e-01 +6.7596196199219527e-01 +2.4945692143071891e+00
0 +2.0596857067425747e+00 +2.0596857067425747e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.7202082967627694e+00 +1.7202082967627694e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.7829319802220942e+00 -9.1311642913039659e-01 +1.7396311021833952e+00
9 -8.8577809579452715e-01 -1.2894706640723275e-01 +1.5136620587745888e+00
4 +6.0238434104876415e+00 +6.1993353468217638e+00 +3.5098387266824460e-01
15 -2.5012557770550812e+00 -7.3037633430072058e-01 +3.5417588855087212e+00
17 -1.0227942471438283e+00 +1.0477948237330728e+00 +4.1411781417538016e+00
23 -6.0293452195778174e+00 -2.6625685218588808e+00 +6.7335533954378732e+00
5 +1.5412500175456483e+00 +1.8516506400496282e+00 +6.2080124500795986e-01
42 -1.1320367069757626e+01 -3.4911733138348922e+00 +1.5658387511845469e+01
19 -5.0652795239157209e+00 -2.4537601925133035e+00 +5.2230386628048349e+00
6 -3.5303378718842904e-01 +8.6044461619583679e-02 +8.7815649761602543e-01
9 -1.2312209924125739e+00 -4.2052733670385489e-01 +1.6213873114174380e+00
21 -4.0636039546567373e+00 -1.1346503138353001e+00 +5.8579072816428743e+00
52 -1.5392505117993675e+01 -5.0485889425913530e+00 +2.0687832350804644e+01
5 -2.1060203001871081e-01 +3.7226357195448756e-02 +4.9565677442831912e-01
0 +8.6644700709848443e+00 +8.6644700709848443e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +2.3368488379117696e+00 +2.8857487075354378e+00 +1.0977997392473364e+00
34 -9.8733130924056027e+00 -3.9232280453038126e+00 +1.1900170094203581e+01
30 -7.2153771968977223e+00 -2.3272691425589378e+00 +9.7762161086775698e+00
14 -3.3033510562049804e+00 -1.7907536150906087e+00 +3.0251948822287433e+00
52 -1.3002533924904451e+01 -2.6108093935991472e+00 +2.0783449062610607e+01
10 -1.7525835058473431e+00 -8.0688740592429209e-01 +1.8913921998461021e+00
12 +2.6988293073752625e+00 +3.9589431233105787e+00 +2.5202276318706325e+00
10 -1.5545146734979927e+00 -6.1128057662873037e-01 +1.8864681937385246e+00
14 -9.5903384824803428e-01 +5.7242754516122840e-01 +3.0629227868185254e+00
29 -4.5966817911406528e+00 +4.8704044607052355e-02 +9.2907716714954098e+00
32 -6.6668047830006296e+00 -1.1749964537163644e+00 +1.0983616658568531e+01
16 -2.2498471151436314e+00 -3.7510508600573722e-01 +3.7494840582757885e+00
0 +5.1449560451804732e+00 +5.1449560451804732e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1905714225986124e+00 +8.1905714225986124e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -8.9490319755544512e+00 -3.4908343082195818e+00 +1.0916395334669739e+01
10 +9.0537534917714257e-01 +1.8364119570036888e+00 +1.8620732156530924e+00
0 +3.8672183397598627e+00 +3.8672183397598627e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1504290614809580e+00 +8.1504290614809580e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -3.1632283817132665e+00 -6.0546545637073423e-01 +5.1155258506850645e+00
11 -8.4371489377040643e-01 +1.6583489892788528e-01 +2.0190995853965834e+00
3 +1.2030961729450036e+00 +1.2789103959787567e+00 +1.5162844606750614e-01
35 -9.6351354209459075e+00 -3.5429135154783626e+00 +1.2184443810935090e+01
8 -8.5103381542825129e-01 -1.9024182139079926e-01 +1.3215839880749041e+00
8 +4.7815917905074450e+00 +5.3796652696748932e+00 +1.1961469583348965e+00
0 +4.2135628531977503e+00 +4.2135628531977503e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.8807223386121068e+00 -2.0999889701467027e+00 +5.5614667369308082e+00
14 -2.8333720924381582e+00 -1.3206322073871735e+00 +3.0254797701019696e+00
18 -3.2352679896780225e+00 -9.9338292399791195e-01 +4.4837701313602212e+00
12 -1.9069114257710877e+00 -7.2239917008667653e-01 +2.3690245113688224e+00
0 +4.7708135185537435e+00 +4.7708135185537435e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -3.6066712806414687e+00 -8.3744616900093583e-01 +5.5384502232810657e+00
2 +4.1777704642319229e+00 +4.2178696538431533e+00 +8.0198379222460758e-02
27 -4.2800295243973343e+00 -8.3666063203748919e-02 +8.3927269223871708e+00
18 -4.1029687951601987e+00 -1.8487928566159999e+00 +4.5083518770883977e+00
2 +1.8128194909174331e+00 +1.8718771999999091e+00 +1.1811541816495197e-01
22 -5.8836469759906320e+00 -2.6461260316235107e+00 +6.4750418887342427e+00
0 +8.5569475887310755e+00 +8.5569475887310755e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -2.3892191029110412e+00 +3.4434092500705837e-02 +4.8473063908234941e+00
51 -1.2160406356735017e+01 -1.9853385045511929e+00 +2.0350135704367649e+01
2 +3.7683167128555493e+00 +3.7985557785543609e+00 +6.0478131397623258e-02
9 +7.0746419095720103e-01 +1.4549133939812990e+00 +1.4948984060481960e+00
34 -9.2439143241017945e+00 -3.3935456079103594e+00 +1.1700737432382869e+01
8 +1.5308488195066952e+00 +2.1866276414177683e+00 +1.3115576438221463e+00
7 +4.3651598810729464e+00 +4.9100981484445612e+00 +1.0898765347432295e+00
29 -8.2547914379505549e+00 -3.4987643218497562e+00 +9.5120542322015975e+00
0 +9.6953754170456126e+00 +9.6953754170456126e+00 +0.0000000000000000e+00
25 -3.1878782657624400e+00 +7.0280283117972919e-01 +7.7813621938843385e+00
24 -4.1504336306621274e+00 -6.6664389648016797e-01 +6.9675794683639189e+00
15 -3.2292739719895183e+00 -1.5061240794984161e+00 +3.4462997849822044e+00
21 -4.7314682197296500e+00 -1.7094542772780295e+00 +6.0440278849032412e+00
11 -2.5817172321322674e+00 -1.4516435900485867e+00 +2.2601472841673615e+00
0 +8.9715990333164974e+00 +8.9715990333164974e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.9873194300120716e+00 +8.9873194300120716e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.9071660766503795e+00 -2.4421881195841144e+00 +4.9299559141325302e+00
22 -5.7109852991148822e+00 -2.6220579521479683e+00 +6.1778546939338277e+00
21 -2.8944002432190148e+00 +1.3454036286320648e-01 +6.0578812121644425e+00
0 +8.1104586677297767e+00 +8.1104586677297767e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.8710963963951706e+00 +1.9743158033789321e+00 +2.0643881396752306e-01
0 +6.4141654906544376e+00 +6.4141654906544376e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -3.0348131924382100e+00 -1.5946492322804358e+00 +2.8803279203155485e+00
32 -6.0015623559071853e+00 -6.5270489976690182e-01 +1.0697714912280567e+01
12 -1.0851285393164778e+00 +1.4101209505869372e-01 +2.4522812687503430e+00
0 +7.7928466583211886e+00 +7.7928466583211886e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +9.8999431037530528e-01 +1.0985239183946121e+00 +2.1705921603861356e-01
21 -1.6042192790806995e+00 +1.2608119955051769e+00 +5.7300625491717527e+00
12 -1.9330779708355257e+00 -7.4346198956071419e-01 +2.3792319625496230e+00
16 -3.7424231744001988e+00 -1.7140932573287424e+00 +4.0566598341429128e+00
33 -8.2455980509706102e+00 -2.6588135846420959e+00 +1.1173568932657028e+01
2 +4.6609235180931528e+00 +4.6971036409566427e+00 +7.2360245726979855e-02
19 -3.0233510695933665e+00 -5.5516219447013748e-01 +4.9363777502464581e+00
48 -1.3714929876421511e+01 -4.3417603694154119e+00 +1.8746339014012200e+01
30 -7.6200120657896742e+00 -2.5732340499008806e+00 +1.0093556031777588e+01
1 +2.2336771591989271e+00 +2.2430748498472313e+00 +1.8795381296608404e-02
6 +1.1386860735905753e+00 +1.4979481263286845e+00 +7.1852410547621837e-01
8 -9.4408218833100133e-01 -2.5102695287884202e-01 +1.3861104709043186e+00
29 -6.6713888199188043e+00 -1.9228922767277894e+00 +9.4969930863820302e+00
0 +7.8240238308512478e+00 +7.8240238308512478e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -2.0208452283267926e+00 -1.1628141428826000e+00 +1.7160621708883852e+00
43 -1.2633180964809231e+01 -4.5361067258051504e+00 +1.6194148478008159e+01
21 -5.1985578797049277e+00 -2.1936924047249549e+00 +6.0097309499599456e+00
25 -6.5756363818770618e+00 -2.6704574230828890e+00 +7.8103579175883455e+00
0 +5.3448251851629909e+00 +5.3448251851629909e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -9.0655989717993979e-01 -4.0771405439085662e-01 +9.9769168557816634e-01
35 -9.3826700294144807e+00 -3.2733467568489685e+00 +1.2218646545131024e+01
13 -2.6598096272238854e+00 -1.2038092765255395e+00 +2.9120007013966918e+00
28 -7.2715067306490164e+00 -2.7059840540944120e+00 +9.1310453531092080e+00
23 -2.2446775919119490e+00 +1.0908904568356861e+00 +6.6711360974952703e+00
10 +1.5616951897440678e-01 +1.0221813855839610e+00 +1.7320237332191084e+00
32 -7.5095568726792221e+00 -2.0319501978151644e+00 +1.0955213349728115e+01
3 +2.5395182668814744e+00 +2.6816365176954751e+00 +2.8423650162800129e-01
3 +2.9652558698771929e+00 +3.0739519186011730e+00 +2.1739209744796018e-01
11 -2.5639669312290545e+00 -1.4338137769515633e+00 +2.2603063085549824e+00
34 -8.1125799141186050e+00 -2.1265063831130351e+00 +1.1972147062011139e+01
15 -3.3710353914830558e+00 -1.5908668422684209e+00 +3.5603370984292697e+00
16 -3.1020304218230601e+00 -1.1339970102588337e+00 +3.9360668231284528e+00
7 -1.1766579359123597e+00 -6.7677044120798246e-01 +9.9977498940875442e-01
9 -1.7434073645182506e+00 -1.0137749208464006e+00 +1.4592648873437000e+00
3 +2.0520787578006647e+00 +2.1373566213771924e+00 +1.7055572715305534e-01
4 +7.4871450735972545e-01 +9.2259591045968481e-01 +3.4776280619991873e-01
18 -3.9290206381673523e+00 -1.6520460736688731e+00 +4.5539491289969583e+00
5 +1.5343049364737000e+00 +1.7980598248341719e+00 +5.2750977672094379e-01
18 -4.4911072080034868e+00 -2.2108913693958456e+00 +4.5604316772152824e+00
0 +4.6386533716621630e+00 +4.6386533716621630e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +8.0874401526164696e-01 +8.1520138620904881e-01 +1.2914741894803683e-02
29 -4.9149606845369691e+00 -1.5880751061050935e-01 +9.5123063478529204e+00
37 -8.0357467759013481e+00 -1.5127717719992007e+00 +1.3045950007804295e+01
20 -4.3694976945211339e+00 -1.6060830818697718e+00 +5.5268292253027242e+00
6 -4.7231050362935179e-02 +3.0361968334640999e-01 +7.0170146741869033e-01
7 -1.3053247474675533e+00 -7.4963405957668883e-01 +1.1113813757817290e+00
16 -3.7231405987031083e+00 -1.8033375603361437e+00 +3.8396060767339293e+00
15 -1.4011042557305364e+00 +2.8088497751114794e-01 +3.3639784664833687e+00
18 -4.5740925742765297e+00 -2.3126167830384174e+00 +4.5229515824762245e+00
6 -6.6024000806399119e-01 -2.8593370052500955e-01 +7.4861261507796328e-01
7 -9.1194698145946340e-01 -4.0280092904326903e-01 +1.0182921048323887e+00
0 +9.7935879552521605e+00 +9.7935879552521605e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +4.3960940655707041e+00 +4.4026953335298860e+00 +1.3202535918363623e-02
22 -3.1171909066944474e+00 +1.2668794243462678e-02 +6.2597194018758202e+00
20 -5.2133225800247702e+00 -2.5377387095224617e+00 +5.3511677410046170e+00
0 +4.5546209322296880e+00 +4.5546209322296880e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -7.2384916701344881e-01 -1.5889922420520808e-01 +1.1298998856164815e+00
0 +4.4854036738848553e+00 +4.4854036738848553e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.8655648588180695e+00 +2.8655648588180695e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +7.6365671487041986e-02 +3.7647342302296050e-01 +6.0021550307183702e-01
62 -1.6700789505990535e+01 -3.5044440156181103e+00 +2.6392690980744849e+01
27 -7.3649275298169110e+00 -3.0191490669116350e+00 +8.6915569258105521e+00
36 -9.8751294357683825e+00 -3.4944596965189740e+00 +1.2761339478498817e+01
60 -1.7354480456466135e+01 -4.8412094388476765e+00 +2.5026542035236915e+01
27 -6.3290532368070069e+00 -2.1490483232046356e+00 +8.3600098272047418e+00
7 +3.3967345475436961e-01 +8.4036785490073296e-01 +1.0013888002927267e+00
8 +9.6228140650290506e-02 +7.6118876836179838e-01 +1.3299212554230158e+00
5 +3.8762235194521022e-01 +6.4985745465941491e-01 +5.2447020542840939e-01
28 -7.8389220280929850e+00 -3.3640950849162032e+00 +8.9496538863535626e+00
20 -4.8211999505984453e+00 -2.0286112570334622e+00 +5.5851773871299661e+00
31 -7.0008654050669294e+00 -1.7762054324633425e+00 +1.0449319945207174e+01
24 -6.4697387628344680e+00 -2.9274070753371007e+00 +7.0846633749947348e+00
9 +1.7682212776057060e-01 +9.4117309290576712e-01 +1.5287019302903930e+00
25 -6.8956286391727124e+00 -3.0922529582676206e+00 +7.6067513618101836e+00
11 -2.0983728791973997e+00 -1.0845009958977441e+00 +2.0277437665993112e+00
7 -1.0036778824299075e+00 -4.8971099973675081e-01 +1.0279337653863134e+00
0 +6.4999300361390171e+00 +6.4999300361390171e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -5.7083667482437663e+00 +5.2807695877435501e-02 +1.1522348888242403e+01
19 -8.4894775705432757e-01 +1.6203243444966611e+00 +4.9385442031019773e+00
31 -8.0994904254779776e+00 -2.9686706173552384e+00 +1.0261639616245478e+01
0 +3.8551178977365002e+00 +3.8551178977365002e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.1224254602563089e+01 -3.1786008029659607e+00 +1.6091307599194259e+01
17 -3.1015217685266707e+00 -1.0455709506748798e+00 +4.1119016357035818e+00
0 +4.8897250818951168e+00 +4.8897250818951168e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -1.2019333651352603e+01 -4.2560137540129386e+00 +1.5526639794679330e+01
25 -4.7974046930482865e+00 -8.9168810664379050e-01 +7.8114331728089921e+00
40 -1.0016040135779072e+01 -2.5989345553053722e+00 +1.4834211160947399e+01
17 -4.0822007285760469e+00 -2.0106141995482627e+00 +4.1431730580555683e+00
2 +3.0105207311323658e+00 +3.0807138393118203e+00 +1.4038621635890891e-01
36 -9.8360815302400688e+00 -3.5675269255215438e+00 +1.2537109209437050e+01
15 -3.7526287413658528e+00 -1.9860934762773650e+00 +3.5330705301769756e+00
13 -2.3180393779007806e+00 -8.7601138478913443e-01 +2.8840559862232924e+00
8 -1.5786803594565875e+00 -9.2031928227924453e-01 +1.3167221543546859e+00
1 +4.0782599236807275e+00 +4.0856047531634854e+00 +1.4689658965515662e-02
8 +2.5931449776371007e-01 +9.3969112446958514e-01 +1.3607532534117501e+00
16 -3.5396067016703716e+00 -1.5678645425304607e+00 +3.9434843182798218e+00
36 -1.0541962655856231e+01 -4.0821050578208888e+00 +1.2919715196070685e+01
0 +3.0651105399469105e+00 +3.0651105399469105e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +4.5110564798192954e-01 +7.5135175442362634e-01 +6.0049221288339361e-01
22 -5.8108514917032332e+00 -2.7274674767866465e+00 +6.1667680298331735e+00
12 -8.2060512981684752e-01 +4.4242177425771079e-01 +2.5260538081491166e+00
10 -9.6725646584689429e-01 -1.0009479912246633e-01 +1.7343233334488559e+00
21 -5.2543289596321410e+00 -2.3381918563619917e+00 +5.8322742065402986e+00
0 +7.0569372240268606e+00 +7.0569372240268606e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.6446967668276793e+00 -7.9576282924854702e-01 +1.6978678751582645e+00
14 -2.8496925849330639e+00 -1.3406954998997365e+00 +3.0179941700666548e+00
0 +5.1068839972466513e+00 +5.1068839972466513e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.7243500934456470e+00 +4.7243500934456470e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -4.8873107654907146e+00 -1.9354084509460283e+00 +5.9038046290893726e+00
53 -1.3848563397722007e+01 -3.2438614560941037e+00 +2.1209403883255806e+01
5 +2.0573951779381376e+00 +2.3208624241320055e+00 +5.2693449238773571e-01
27 -5.2556383509204965e+00 -1.0661201056955969e+00 +8.3790364904497991e+00
1 +4.0685934828909174e+00 +4.0707474560851473e+00 +4.3079463884598823e-03
5 +1.0331723326728994e+00 +1.3022424279576645e+00 +5.3814019056953022e-01
16 -1.6866958597107748e+00 +2.5608577794074838e-01 +3.8855632753030465e+00
25 -6.4082259013685290e+00 -2.6345859241746656e+00 +7.5472799543877267e+00
0 +4.3558672542142762e+00 +4.3558672542142762e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.8217189980479054e+00 -2.0595499132350041e+00 +5.5243381696258025e+00
0 +3.9794267011208966e+00 +3.9794267011208966e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +9.1975691171511809e+00 +9.1975691171511809e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -6.3747752863008982e+00 -2.7929213933379353e+00 +7.1637077859259257e+00
0 +3.8632937013674820e+00 +3.8632937013674820e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -1.3127955727822780e+00 -1.9928199608721719e-02 +2.5857347463471125e+00
1 +4.6096239761848414e+00 +4.6215804995011469e+00 +2.3913046632610957e-02
18 -2.4699614548529381e+00 -2.0335702276942769e-01 +4.5332088641670207e+00
11 -7.8499314094969552e-01 +3.1503463865640535e-01 +2.2000555592122018e+00
0 +1.4729182963966094e+00 +1.4729182963966094e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -1.0418414996909927e+01 -3.7058383489826268e+00 +1.3425153295854601e+01
7 +1.1722422050815320e+00 +1.7316056724697066e+00 +1.1187269347763493e+00
0 +3.3430221956800894e+00 +3.3430221956800894e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.0743494779379727e+01 -2.7071468077797167e+00 +1.6072695943200021e+01
9 -1.2181982633285555e+00 -4.2748882999134086e-01 +1.5814188666744293e+00
9 -1.0896183975711162e+00 -3.7505376557068359e-01 +1.4291292640008653e+00
18 -4.5496787849762894e+00 -2.1636893291136960e+00 +4.7719789117251867e+00
11 +3.2426007011330986e+00 +4.3760817852989033e+00 +2.2669621683316095e+00
10 -2.1149601687458377e+00 -1.2047769776925152e+00 +1.8203663821066449e+00
2 +2.1555663217100332e+00 +2.2117428322907715e+00 +1.1235302116147672e-01
0 +1.2586076586817869e+00 +1.2586076586817869e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -2.5311630271085326e+00 -8.8724752176313837e-01 +3.2878310106907884e+00
2 +7.6347097419186216e-01 +8.1875867871428376e-01 +1.1057540904484320e-01
0 +4.9012028177244673e+00 +4.9012028177244673e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.1314976835749322e+00 -9.6832312220529904e-01 +2.3263491227392663e+00
19 -3.1548820200601861e+00 -5.8354629670210523e-01 +5.1426714467161618e+00
18 -4.3035369978859075e+00 -1.9700600389502974e+00 +4.6669539178712203e+00
56 -1.4223083959890062e+01 -2.6498670214201141e+00 +2.3146433876939895e+01
0 +1.7037020782515135e+00 +1.7037020782515135e+00 +0.0000000000000000e+00
50 -1.4729465141135677e+01 -4.7317227463532241e+00 +1.9995484789564905e+01
2 +6.6734084974874275e-01 +7.2865487803833151e-01 +1.2262805657917752e-01
40 -1.1162822174860956e+01 -3.8406606189626680e+00 +1.4644323111796577e+01
14 -1.7163225705716361e+00 -1.9620336808107197e-01 +3.0402384049811282e+00
11 -2.2439948497260973e+00 -1.2396601825197351e+00 +2.0086693344127244e+00
11 -4.7783585864930611e-01 +6.6260329292882592e-01 +2.2808783031562641e+00
15 -3.0411815209082311e+00 -1.2330523941691767e+00 +3.6162582534781089e+00
16 -2.9738515691981080e+00 -9.5604720933753651e-01 +4.0356087197211430e+00
17 -2.9992930664102788e+00 -7.9962157377335386e-01 +4.3993429852738499e+00
20 -2.4362387468307043e+00 +3.0633282476568180e-01 +5.4851431431927722e+00
9 -1.4483151433452690e-01 +6.5855142085699958e-01 +1.6067658703830530e+00
1 +8.5687313971966805e-01 +8.6885708493782676e-01 +2.3967890436317418e-02
22 -6.0236562020511579e+00 -2.8315889104930179e+00 +6.3841345831162801e+00
4 -7.2095760164913258e-02 +1.4577357566653681e-01 +4.3573867166290015e-01
10 -2.8114812408808110e-01 +6.6609168228123306e-01 +1.8944796127386283e+00
0 +6.1696695157883621e+00 +6.1696695157883621e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.6607967322930550e+00 +1.6607967322930550e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.2066006691376678e+00 +4.2066006691376678e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +7.0060441602186412e+00 +7.0060441602186412e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.0254890803356719e+01 -1.6400074201010377e+00 +1.7229766766511364e+01
2 +4.7071571224020552e+00 +4.7656057784606736e+00 +1.1689731211723675e-01
5 -4.9702377128067976e-01 -1.8805298770715861e-01 +6.1794156714704229e-01
8 -1.4104304105045653e+00 -8.1450109852117336e-01 +1.1918586239667839e+00
23 -5.5393731015677554e+00 -2.0863351507444161e+00 +6.9060759016466786e+00
16 -3.5305103261269979e+00 -1.5727463657613416e+00 +3.9155279207313125e+00
0 +5.3386738421558464e+00 +5.3386738421558464e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.4824446130924844e+00 +1.5994474798996055e+00 +2.3400573361424204e-01
45 -1.2694325468714663e+01 -4.0384972331913813e+00 +1.7311656471046561e+01
8 +2.7875947744836540e+00 +3.3773612425818649e+00 +1.1795329361964217e+00
9 -2.0468804083383940e-01 +6.0485890708047663e-01 +1.6190938958286321e+00
9 -1.5817905150728055e+00 -8.2630235789766182e-01 +1.5109763143502875e+00
0 +3.1307926311425929e+00 +3.1307926311425929e+00 +0.0000000000000000e+00
23 -6.0729227668342558e+00 -2.6318535962435590e+00 +6.8821383411813937e+00
25 -6.2550299294779395e+00 -2.5315484119326084e+00 +7.4469630350906622e+00
10 -1.0353240492794606e+00 -6.1362708336367255e-02 +1.9479226818861868e+00
16 -3.9586793521291606e+00 -1.9661674227737924e+00 +3.9850238587107363e+00
5 -5.5777899361549288e-01 -2.3727381855260088e-01 +6.4101035012578400e-01
8 +9.9314809682379934e-01 +1.6637079003694870e+00 +1.3411196070913753e+00
0 +3.7298719157210876e+00 +3.7298719157210876e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.5225782453000054e+00 +4.5225782453000054e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.0445764047008872e+01 -1.7748935565302140e+00 +1.7341740980957315e+01
27 -4.4122147635776114e+00 -2.5756522199358312e-01 +8.3092990831680567e+00
13 -3.1153443936819523e+00 -1.7052971612887649e+00 +2.8200944647863748e+00
22 -5.4384638355675063e+00 -2.2684872035060994e+00 +6.3399532641228138e+00
0 +4.1304561725669027e+00 +4.1304561725669027e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +2.1814258687494439e+00 +2.4078433172578810e+00 +4.5283489701687429e-01
0 +9.2260494677632146e+00 +9.2260494677632146e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -2.9716819660293483e+00 -6.1666856467019038e-01 +4.7100268027183159e+00
3 +3.2851525805564208e+00 +3.3724387031630974e+00 +1.7457224521335313e-01
15 -3.7922759133465176e+00 -1.9628911141822907e+00 +3.6587695983284538e+00
14 -3.2914257969220069e+00 -1.7846669156932928e+00 +3.0135177624574281e+00
0 +9.1162298198734444e+00 +9.1162298198734444e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.7978275090756108e+00 -2.3893034958869643e+00 +4.8170480263772930e+00
23 -5.3003618410612185e+00 -1.8550612546335215e+00 +6.8906011728553942e+00
0 +6.7486288468239852e+00 +6.7486288468239852e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -3.9535286299348451e+00 -1.9935704399613741e+00 +3.9199163799469421e+00
21 -4.8362770998768747e+00 -1.8576190938104937e+00 +5.9573160121327620e+00
14 +4.2829422241340875e-01 +2.0154918172388703e+00 +3.1743951896509230e+00
7 -1.0546399510511177e+00 -5.5847002664135914e-01 +9.9233984881951720e-01
13 -1.5474269934381342e+00 -1.2699994717769458e-01 +2.8408540925208792e+00
14 -2.5437557305870486e+00 -8.8700470045354463e-01 +3.3135020602670080e+00
43 -1.2277861001160144e+01 -4.2633955489132553e+00 +1.6028930904493777e+01
0 +2.4162536641532273e+00 +2.4162536641532273e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.3185755803126948e+00 +6.3185755803126948e+00 +0.0000000000000000e+00
49 -1.2339409098923994e+01 -2.6953739946357329e+00 +1.9288070208576521e+01
4 +3.3648468608759083e+00 +3.5686497957832111e+00 +4.0760586981460545e-01
25 -7.0387930005229444e+00 -3.1362646230936000e+00 +7.8050567548586889e+00
0 +8.1620946674825756e+00 +8.1620946674825756e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.3182191115572506e+00 -2.7162139755907067e-01 +4.0931954279963598e+00
1 +2.5264694774584115e+00 +2.5379098507467788e+00 +2.2880746576734445e-02
18 -2.2200434172774832e+00 +1.4158649037451054e-01 +4.7232598153039875e+00
3 +7.7804462256593698e-01 +8.8431378407022798e-01 +2.1253832300858200e-01
7 -1.9571301704600330e-01 +2.8803960201430012e-01 +9.6750523812060685e-01
7 +2.3879010112410004e-01 +7.0891639161583520e-01 +9.4025258098347031e-01
19 -4.5559099553123472e+00 -2.0823967890281527e+00 +4.9470263325683890e+00
2 +3.0916309726736007e+00 +3.1400729308077695e+00 +9.6883916268337700e-02
8 -1.0325867836155176e+00 -3.3562216970071557e-01 +1.3939292278296040e+00
12 -2.4770848184964818e+00 -1.3221799825106233e+00 +2.3098096719717169e+00
0 +4.3735865109596173e+00 +4.3735865109596173e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +7.9914692980467716e-01 +8.0752308669687345e-01 +1.6752313784392570e-02
4 +1.5027018452786844e-01 +3.6421977791074678e-01 +4.2789918676575667e-01
0 +6.7869625789012487e+00 +6.7869625789012487e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.2072193146354584e+00 -1.4347670884736474e+00 +3.5449044523236219e+00
0 +1.3716518184563210e+01 +1.3716518184563210e+01 +0.0000000000000000e+00
7 +9.8893605477497903e-01 +1.5362155315340402e+00 +1.0945589535181224e+00
11 -1.3045864785595525e+00 -2.7062559342166814e-01 +2.0679217702757686e+00
16 -7.0466762502762048e-01 +1.2130454776643136e+00 +3.8354262053838681e+00
13 -1.7575674451290819e+00 -3.2350400185046890e-01 +2.8681268865572260e+00
9 -9.5088597691316856e-01 -1.7491319847840625e-01 +1.5519455568695246e+00
23 -5.2088747586294408e+00 -1.9127396104201271e+00 +6.5922702964186275e+00
44 -1.3100568919385491e+01 -4.6269222225232820e+00 +1.6947293393724419e+01
4 +1.1060067166124989e+00 +1.2870276357325445e+00 +3.6204183824009117e-01
2 +9.2414047197593607e-01 +9.7592124800145275e-01 +1.0356155205103335e-01
2 +4.6600001635782258e+00 +4.7314347328682285e+00 +1.4286913858000538e-01
1 +5.4271795000974032e+00 +5.4373990532452137e+00 +2.0439106295620846e-02
5 +2.2315480643544419e+00 +2.4909600932252336e+00 +5.1882405774158347e-01
12 -1.4575939184016624e+00 -1.6909873115470742e-01 +2.5769903744939100e+00
15 -3.0354404477280186e+00 -1.3348761778711418e+00 +3.4011285397137536e+00
19 -4.8794447028265671e+00 -2.3919912674822439e+00 +4.9749068706886463e+00
16 -3.8976502622885834e+00 -1.8573618286164182e+00 +4.0805768673443303e+00
23 -5.1366622570254181e+00 -1.8215183515357043e+00 +6.6302878109794277e+00
3 -1.9254825518316032e-02 +1.1898932983619392e-01 +2.7648831070901991e-01
13 -3.0318362834040355e+00 -1.6432834971165557e+00 +2.7771055725749596e+00
22 -5.3628782416830569e+00 -2.1801113628150084e+00 +6.3655337577360971e+00
14 -3.1564352738581354e+00 -1.5433453794932119e+00 +3.2261797887298469e+00
34 -9.7435145491862123e+00 -3.8833446942106202e+00 +1.1720339709951183e+01
0 +4.1600984972534345e+00 +4.1600984972534345e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -1.0568222208500515e+01 -4.0134521631875009e+00 +1.3109540090626028e+01
50 -1.4777683104073571e+01 -4.7750176375725495e+00 +2.0005330933002043e+01
20 -3.4718486994765163e+00 -7.2240090027320658e-01 +5.4988955984066195e+00
14 -2.2878115021119845e+00 -6.4315174338721448e-01 +3.2893195174495400e+00
9 +5.0934264924144657e-01 +1.2681756180195052e+00 +1.5176659375561172e+00
16 -4.1062922900082279e+00 -2.1286485835279345e+00 +3.9552874129605868e+00
22 -3.5769965347217552e+00 -4.2120545726068670e-01 +6.3115821549221369e+00
10 +5.8761596598834220e-01 +1.4546577402776224e+00 +1.7340835485785604e+00
27 -7.1634153710494912e+00 -3.0071987054814331e+00 +8.3124333311361163e+00
31 -8.2097265931392620e+00 -2.9469649423535511e+00 +1.0525523301571422e+01
10 -8.7048884801850157e-01 -2.3669177795400120e-02 +1.6936393404462029e+00
32 -8.5498947054146406e+00 -3.1770205851965905e+00 +1.0745748240436100e+01
0 +8.2050550311085715e+00 +8.2050550311085715e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -2.0157955986719065e+00 -3.8858114644363972e-01 +3.2544289044565335e+00
0 +1.4722855456748235e+01 +1.4722855456748235e+01 +0.0000000000000000e+00
2 +3.1527948920864897e+00 +3.2262471822801615e+00 +1.4690458038734366e-01
11 -2.2140908824698498e+00 -1.0628240259018753e+00 +2.3025337131359489e+00
5 -1.8417938957727298e-01 +5.3178695747466698e-02 +4.7471617064947935e-01
0 +1.0068934534850692e+01 +1.0068934534850692e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +1.9602781965137277e+00 +1.9602781965137277e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.7747871607880708e+00 +8.7747871607880708e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.8842645385229627e+01 +1.8842645385229627e+01 +0.0000000000000000e+00
15 -2.1294867500139700e+00 -2.8345940567526728e-01 +3.6920546886774055e+00
23 -5.6613704764009212e+00 -2.3410725515948867e+00 +6.6405958496120689e+00
0 +6.4360355124212818e+00 +6.4360355124212818e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -3.6647733985369157e-01 +4.7773559613470296e-01 +1.6884258719767891e+00
7 -4.9008557252405005e-01 -2.7095388279004595e-02 +9.2598036849009091e-01
15 -2.5351375230961510e+00 -7.0435657231603654e-01 +3.6615619015602290e+00
0 +8.7857682776656194e+00 +8.7857682776656194e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +3.3802426815063491e-01 +5.9531890851990887e-01 +5.1458928073854793e-01
27 -7.3226240365165092e+00 -3.1342377563623787e+00 +8.3767725603082610e+00
8 -8.4411242813162790e-01 -2.7773775623903241e-01 +1.1327493437851910e+00
29 -7.8355268390989581e+00 -3.2295595628530611e+00 +9.2119345524917939e+00
13 -1.1226222026988086e+00 +2.2229223747827742e-01 +2.6898288803541721e+00
3 +2.2541412014664086e-01 +3.0551310501801510e-01 +1.6019796974274847e-01
0 +2.0670880186367633e+00 +2.0670880186367633e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +9.1962231402055838e-01 +1.7593584334116410e+00 +1.6794722387821652e+00
5 +3.7428262927258018e+00 +4.0013665458035614e+00 +5.1708050615551926e-01
18 -4.5540520402221807e+00 -2.2934417651760119e+00 +4.5212205500923375e+00
0 +6.1791640125929286e+00 +6.1791640125929286e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.3925558261047870e+00 -1.7808018365110132e+00 +3.2235079791875476e+00
1 +1.1575695200733032e+00 +1.1689331733409718e+00 +2.2727306535337277e-02
21 -4.1142310474495440e+00 -1.2086602334855967e+00 +5.8111416279278947e+00
3 +2.6657390650749768e+00 +2.7658504054531603e+00 +2.0022268075636696e-01
17 -4.5366773030060736e+00 -2.3025137509437075e+00 +4.4683271041247323e+00
3 +4.0997011886608004e-01 +5.1875070923966948e-01 +2.1756118074717889e-01
2 +2.8702903367033508e+00 +2.9144694998940208e+00 +8.8358326381340113e-02
15 -2.5374171466355682e+00 -8.1322182150115419e-01 +3.4483906502688280e+00
20 -5.3015191778160071e+00 -2.5292804827440567e+00 +5.5444773901439008e+00
0 +4.5876557361430663e+00 +4.5876557361430663e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -1.1150077732497010e+00 +5.9630471028270104e-01 +3.4226249670648041e+00
0 +4.3017555472426032e+00 +4.3017555472426032e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.6683084600408149e+00 -1.4401853392231629e+00 +2.4562462416353039e+00
21 -1.5868160687529675e+00 +1.3523392760977098e+00 +5.8783106897013546e+00
10 -3.6195761947098859e-01 +5.2879448456946099e-01 +1.7815042080808992e+00
0 +4.1823142912031503e+00 +4.1823142912031503e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.0838074826855539e+00 +8.0838074826855539e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -2.6147589997248746e+00 -1.2734097580194459e+00 +2.6826984834108574e+00
14 +7.2704716164044392e-02 +1.5652002480163814e+00 +2.9849910637046739e+00
33 -9.5176165479967629e+00 -3.8044109243447171e+00 +1.1426411247304092e+01
4 +1.4835560995026036e+00 +1.6751644377313872e+00 +3.8321667645756730e-01
5 +1.4286124036996171e+00 +1.7526299908760152e+00 +6.4803517435279634e-01
24 -5.1630120795646564e+00 -1.6369468600227481e+00 +7.0521304390838164e+00
0 +1.4525893984320856e+01 +1.4525893984320856e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +1.3149893287816276e+01 +1.3149893287816276e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +6.4669533387510327e+00 +6.4669533387510327e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.9703752327536370e+00 +2.9703752327536370e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.4464735114349210e+01 +1.4464735114349210e+01 +0.0000000000000000e+00
36 -1.0138421161290768e+01 -3.8724289387959132e+00 +1.2531984444989710e+01
30 -8.2665803505427036e+00 -3.2247878400113570e+00 +1.0083585021062692e+01
5 -4.4257847053748023e-01 -1.9585479447538123e-01 +4.9344735212419799e-01
0 +2.4942536607255157e+00 +2.4942536607255157e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +9.9265680289679104e+00 +9.9265680289679104e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.5804680802410771e+00 +3.5804680802410771e+00 +0.0000000000000000e+00
43 -1.0916289734196958e+01 -2.9031783692302762e+00 +1.6026222729933366e+01
27 -6.4513948274166895e+00 -2.2766060108903536e+00 +8.3495776330526716e+00
5 -3.0225916485232940e-01 -9.7134960914599944e-03 +5.8509133752173881e-01
2 +6.1025205760690149e+00 +6.1402656304949836e+00 +7.5490108851937521e-02
16 -3.1892414835614877e+00 -1.2394218818103955e+00 +3.8996392035021845e+00
11 -1.6251997280545556e+00 -6.1161681849615768e-01 +2.0271658191167958e+00
2 +1.0581304295791911e+00 +1.1181564001214870e+00 +1.2005194108459172e-01
0 +3.3346921474698341e+00 +3.3346921474698341e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +1.6783373192574587e+00 +2.0272775378252765e+00 +6.9788043713563574e-01
23 -5.9914493828586641e+00 -2.7289998387128804e+00 +6.5248990882915674e+00
0 +2.8540138337821066e+00 +2.8540138337821066e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -5.1633650270024356e+00 -2.3132175959534913e+00 +5.7002948620978886e+00
21 -5.4226497623726866e+00 -2.3979508876518207e+00 +6.0493977494417317e+00
35 -9.7406199157597513e+00 -3.6642151703304364e+00 +1.2152809490858630e+01
9 -1.7833171240551771e+00 -1.0183359388973345e+00 +1.5299623703156850e+00
5 +2.2129485913800462e+00 +2.5075750145409721e+00 +5.8925284632185182e-01
4 +1.6680713840462387e+00 +1.8941482613507628e+00 +4.5215375460904816e-01
54 -1.6051282163548972e+01 -5.1466131476382184e+00 +2.1809338031821508e+01
67 -2.0114519879146055e+01 -5.6758845315065720e+00 +2.8877270695278966e+01
0 +5.7457599936138024e+00 +5.7457599936138024e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -7.8295092576238812e-01 +1.6891033217593820e-01 +1.9037225158766526e+00
34 -8.2824221774225286e+00 -2.3343566993351077e+00 +1.1896130956174842e+01
16 -1.3496872861323137e+00 +5.2176243232652642e-01 +3.7428994369176802e+00
0 +4.8802680337795650e+00 +4.8802680337795650e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -4.6697383337851557e+00 -1.0228017971587282e+00 +7.2938730732528549e+00
0 +2.7526671326832073e+00 +2.7526671326832073e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.1223456075130125e+00 -1.8282938337194512e+00 +4.5881035475871226e+00
23 -3.2720676136587370e+00 +3.8123158160483506e-02 +6.6203815436384410e+00
4 +2.1699926264688938e+00 +2.3827931437299554e+00 +4.2560103452212328e-01
17 -4.5320245846680516e+00 -2.2987913101309196e+00 +4.4664665490742639e+00
23 -4.6222978052551094e+00 -1.2075238723916861e+00 +6.8295478657268465e+00
5 +3.4479800679986674e+00 +3.7095510226031103e+00 +5.2314190920888581e-01
4 -3.0886376092832357e-01 -1.0263590371306730e-01 +4.1245571443051254e-01
13 -2.3658398988990559e-01 +1.1511398846954184e+00 +2.7754477491706480e+00
0 +7.7041379267503043e+00 +7.7041379267503043e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -9.8025726447463377e+00 -3.1658875434560274e+00 +1.3273370202580621e+01
35 -7.0761783949685197e+00 -8.7122254973692903e-01 +1.2409911690463181e+01
3 +1.4707509002585937e+00 +1.6102560854055143e+00 +2.7901037029384135e-01
22 -1.5779951776999779e+00 +1.6580785172024752e+00 +6.4721473898049062e+00
11 +2.3429160380460790e-01 +1.2302149964722715e+00 +1.9918467853353272e+00
13 -1.4152657475626338e+00 -8.3611076187914968e-02 +2.6633093427494376e+00
0 +9.7792271011333121e+00 +9.7792271011333121e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.0944287513357676e-01 +5.3375870605526021e-01 +1.2864031623776739e+00
27 -5.5393184579528425e+00 -1.2261001085465661e+00 +8.6264366988125527e+00
9 +3.1579846250078454e+00 +3.9883597875050367e+00 +1.6607503249943827e+00
29 -8.1349469818559648e+00 -3.3769396973670496e+00 +9.5160145689778304e+00
6 +1.2035983978734874e+00 +1.5501637243293502e+00 +6.9313065291172560e-01
0 +4.0302058865692238e+00 +4.0302058865692238e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -8.8355323823497791e+00 -3.2449093210399953e+00 +1.1181246122619568e+01
0 +2.9145941737887822e+00 +2.9145941737887822e+00 +0.0000000000000000e+00
38 -1.0766727018523202e+01 -3.9134513459675917e+00 +1.3706551345111221e+01
5 -4.7170319901700619e-01 -1.9749812840945768e-01 +5.4841014121509701e-01
16 -2.2834707057894326e+00 -2.4543695000594834e-01 +4.0760675115669684e+00
6 +4.6264355552866743e-01 +8.0734043282944334e-01 +6.8939375460155183e-01
16 -3.4690434282374225e+00 -1.5277051174034231e+00 +3.8826766216679989e+00
7 +5.2942895128096268e-01 +1.0581143538295925e+00 +1.0573708050972597e+00
0 +7.8334003005864936e+00 +7.8334003005864936e+00 +0.0000000000000000e+00
6 -8.2654088390678027e-01 -4.4426570361605933e-01 +7.6455036058144188e-01
1 +3.0340805806613078e+00 +3.0465277967505848e+00 +2.4894432178554027e-02
25 -5.9376688639666524e+00 -2.1735340308605315e+00 +7.5282696662122417e+00
20 -5.0316966399873992e+00 -2.2519900113088744e+00 +5.5594132573570496e+00
8 -5.6585266912727672e-01 +1.2511288696619527e-01 +1.3819311121869440e+00
7 -1.1422872551535583e+00 -6.1454650490654483e-01 +1.0554815004940270e+00
14 -8.1451171704838288e-04 +1.5750358995272573e+00 +3.1517008224886114e+00
0 +2.7468731284373296e+00 +2.7468731284373296e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -6.9254518642869831e+00 -2.1625004913443071e+00 +9.5259027458853520e+00
8 +4.3353087044014655e+00 +4.9969108419421673e+00 +1.3232042750814035e+00
0 +1.8714639349169236e+01 +1.8714639349169236e+01 +0.0000000000000000e+00
15 -3.7393429473863753e+00 -1.9098924601174621e+00 +3.6589009745378265e+00
23 -5.4999116996675328e+00 -2.0306813659599952e+00 +6.9384606674150753e+00
24 -6.6316927093052280e+00 -3.0207976025502647e+00 +7.2217902135099266e+00
47 -1.2732911970616801e+01 -3.5754144892088440e+00 +1.8314994962815913e+01
38 -8.1789682031470292e+00 -1.3630334788692791e+00 +1.3631869448555500e+01
21 -4.7229256541844746e+00 -1.7257982588568246e+00 +5.9942547906553001e+00
0 +3.4167464952641353e+00 +3.4167464952641353e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +4.9733622637827146e-01 +9.0348050902108135e-01 +8.1228856528561977e-01
1 +5.8801102087645685e+00 +5.8958136974506967e+00 +3.1406977372256506e-02
5 +2.2646689466437495e+00 +2.5534327373762902e+00 +5.7752758146508132e-01
22 -5.6830871567212613e+00 -2.5686939946946987e+00 +6.2287863240531252e+00
10 -1.4693651228220261e-01 +7.9073685107687997e-01 +1.8753467267181652e+00
47 -1.4044601225856105e+01 -4.7859733249834591e+00 +1.8517255801745293e+01
2 +2.1952502038541506e+00 +2.2222756824226906e+00 +5.4050957137079969e-02
27 -6.2876438002933677e+00 -2.0283460660154571e+00 +8.5185954685558212e+00
5 +4.1671354830319824e+00 +4.4128009398726720e+00 +4.9133091368137904e-01
2 +4.8313852800576420e+00 +4.8934314949756885e+00 +1.2409242983609303e-01
41 -1.1765561034946906e+01 -4.0616410837337451e+00 +1.5407839902426321e+01
4 +1.0778168035712854e+00 +1.2845243526786092e+00 +4.1341509821464761e-01
7 +6.2543248596720336e-01 +1.1260608586804461e+00 +1.0012567454264856e+00
3 +3.6081585749488170e+00 +3.6983308299956459e+00 +1.8034451009365782e-01
41 -1.1044991098672075e+01 -3.5524920357746557e+00 +1.4984998125794839e+01
17 -9.4016515964065395e-01 +1.1433883667167308e+00 +4.1671070527147691e+00
7 +1.6785107229975891e+00 +2.1732209031189766e+00 +9.8942036024277513e-01
0 +4.0769474455233992e+00 +4.0769474455233992e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +1.3593422009623284e+00 +1.4068891197329583e+00 +9.5093837541259774e-02
14 -2.1959113524856546e+00 -6.0333147596205272e-01 +3.1851597530472038e+00
16 -4.1410588341346726e+00 -2.1020985307884548e+00 +4.0779206066924356e+00
0 +9.3455850912338114e+00 +9.3455850912338114e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -6.8571799013038959e-01 +2.6925714210943363e-01 +1.9099502644796464e+00
0 +9.0186320671083067e+00 +9.0186320671083067e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +7.7797098055758696e-01 +1.0638485952113159e+00 +5.7175522930745792e-01
74 -2.2248428921359739e+01 -5.8612469973752139e+00 +3.2774363847969049e+01
0 +1.3811663249049396e+01 +1.3811663249049396e+01 +0.0000000000000000e+00
36 -9.2086106740758495e+00 -2.9178638562511283e+00 +1.2581493635649442e+01
8 +9.4225476395823993e-01 +1.6006469860624208e+00 +1.3167844442083618e+00
37 -1.0654529415662051e+01 -4.0628477110719574e+00 +1.3183363409180187e+01
0 +7.9100478949339195e+00 +7.9100478949339195e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -8.8395025945975902e+00 -9.9302570927150546e-01 +1.5692953770652169e+01
4 +1.2507423495264289e+00 +1.4485609154110968e+00 +3.9563713176933568e-01
1 +1.0839426346104251e+00 +1.1043951868900663e+00 +4.0905104559282535e-02
26 -5.9120092821317582e+00 -1.9037187608936528e+00 +8.0165810424762114e+00
24 -5.6690404727725889e+00 -1.9768077035877205e+00 +7.3844655383697368e+00
13 -3.0447409372884673e+00 -1.6615858441146014e+00 +2.7663101863477317e+00
0 +5.0714361072939962e+00 +5.0714361072939962e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -9.9823501993719681e+00 -3.9496494303269687e+00 +1.2065401538089999e+01
22 -6.0318232421593345e+00 -2.8352556166294880e+00 +6.3931352510596930e+00
0 +6.7625125658191330e+00 +6.7625125658191330e+00 +0.0000000000000000e+00
80 -2.2191987361149096e+01 -3.9956921495618953e+00 +3.6392590423174397e+01
23 -6.2574290540540760e+00 -2.8675410837049053e+00 +6.7797759406983413e+00
4 +1.7464802102668209e-02 +1.7804745252707921e-01 +3.2116530084882200e-01
64 -1.5716699077542735e+01 -2.0755086827111691e+00 +2.7282380789663133e+01
6 +8.8211487269457933e-01 +1.2185567865469555e+00 +6.7288382770475241e-01
2 +3.5029063538311878e+00 +3.5553931974219957e+00 +1.0497368718161582e-01
7 -5.9630637077840998e-01 -8.7330050033417983e-02 +1.0179526414899840e+00
1 +7.4725932119582836e+00 +7.4989043235395503e+00 +5.2622223162533288e-02
0 +4.8205945191948754e+00 +4.8205945191948754e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +3.3671569592336859e-01 +6.3781041561116059e-01 +6.0218943937558400e-01
11 +3.5781079459181875e-01 +1.3596943806099597e+00 +2.0037671720362820e+00
11 -1.7313821091096537e+00 -5.8389658697769597e-01 +2.2949710442639155e+00
30 -5.6514462404349883e+00 -7.8532380516951283e-01 +9.7322448705309519e+00
21 -5.7791955030386548e+00 -2.7526610517038219e+00 +6.0530689026696658e+00
25 -6.7830739940375109e+00 -2.9424114558153698e+00 +7.6813250764442822e+00
8 +1.4133122461575072e+00 +2.0946674085905954e+00 +1.3627103248661765e+00
16 -2.2890641103376916e+00 -4.2393448664685529e-01 +3.7302592473816727e+00
25 -6.7918458569753026e+00 -2.9491366079032759e+00 +7.6854184981440534e+00
14 -2.0201468699970144e+00 -4.5234864519248008e-01 +3.1355964496090687e+00
10 +2.9951932769556380e+00 +3.8948563230956155e+00 +1.7993260922799550e+00
0 +3.4814183142875836e+00 +3.4814183142875836e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.5048366949714209e+00 +1.5879353465911006e+00 +1.6619730323935933e-01
24 -4.2802093807049291e+00 -7.4827427011177550e-01 +7.0638702211863071e+00
46 -1.3697496324389753e+01 -4.7199131064440945e+00 +1.7955166435891318e+01
11 -2.4757206940253562e+00 -1.3595275943310892e+00 +2.2323861993885341e+00
6 +2.4147242999567302e+00 +2.8375662788568254e+00 +8.4568395780019046e-01
18 -3.5679903710967080e+00 -1.2277633486121426e+00 +4.6804540449691308e+00
32 -8.6769304434137240e+00 -3.2343007817180540e+00 +1.0885259323391340e+01
42 -1.2375865047516189e+01 -4.4352089485138295e+00 +1.5881312198004720e+01
24 -6.4946155908039058e+00 -2.9829132035513348e+00 +7.0234047745051420e+00
0 +4.1469825719464302e+00 +4.1469825719464302e+00 +0.0000000000000000e+00
5 +6.0632120194017247e-01 +9.1242215881878819e-01 +6.1220191375723143e-01
0 +8.2591808581019990e+00 +8.2591808581019990e+00 +0.0000000000000000e+00
13 -2.8696368888656059e+00 -1.4377654511488243e+00 +2.8637428754335632e+00
7 -4.8300533165541726e-01 -1.5466369186780682e-02 +9.3507792493727315e-01
0 +8.4464242233881706e+00 +8.4464242233881706e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.1944462228882022e+00 -5.3079790574397112e-01 +1.3272966342884622e+00
3 +3.1024058488532900e+00 +3.2344732628659774e+00 +2.6413482802537480e-01
12 -2.6536738180972934e+00 -1.3450382811181969e+00 +2.6172710739581930e+00
29 -7.6333024892156311e+00 -2.9769389882945099e+00 +9.3127270018422426e+00
48 -1.3896336080016713e+01 -4.6085891813301529e+00 +1.8575493797373120e+01
0 +9.1996956153213620e+00 +9.1996956153213620e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.2916746174252163e+00 -1.4646513740810145e+00 +3.6540464866884035e+00
13 -9.0724772747343962e-01 +4.3977528592607662e-01 +2.6940460267990325e+00
0 +7.9275464521634946e+00 +7.9275464521634946e+00 +0.0000000000000000e+00
62 -1.8548596944797211e+01 -5.4790277060534924e+00 +2.6139138477487435e+01
6 +1.2924704321021094e+00 +1.6877384351121769e+00 +7.9053600602013496e-01
6 -3.3171488239787195e-01 +2.2533571426822441e-02 +7.0849690764938877e-01
42 -1.2244008274076272e+01 -4.3803622532274611e+00 +1.5727292041697622e+01
28 -6.4879408863560277e+00 -2.0449353257696048e+00 +8.8860111211728459e+00
15 -1.8286391324650033e+00 -1.5196311711353072e-01 +3.3533520307029452e+00
8 +2.1759449822523580e+00 +2.7580617137404237e+00 +1.1642334629761315e+00
22 -5.6711143175442951e+00 -2.5774433938755532e+00 +6.1873418473374837e+00
42 -1.2208204891217054e+01 -4.4330544820434756e+00 +1.5550300818347157e+01
13 -3.1256829511200452e+00 -1.6594343620519800e+00 +2.9324971781361304e+00
38 -1.0836746869828559e+01 -4.0353661266097092e+00 +1.3602761486437700e+01
0 +4.1157508691498172e+00 +4.1157508691498172e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +1.7957613239309698e+00 +2.1439375857027034e+00 +6.9635252354346733e-01
0 +7.1278666291482331e+00 +7.1278666291482331e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.7269098400438114e+00 +6.7269098400438114e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -5.3121414006981960e+00 -2.2760746573539739e+00 +6.0721334866884442e+00
34 -9.7939420537699498e+00 -3.8355457359247027e+00 +1.1916792635690495e+01
16 -2.8146414707509892e+00 -9.4352169230500493e-01 +3.7422395568919686e+00
0 +5.3739985986073977e+00 +5.3739985986073977e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +3.3151171036241323e-02 +1.3430092455333753e+00 +2.6197161489942680e+00
29 -6.1629253730403848e+00 -1.5689335704613956e+00 +9.1879836051579780e+00
0 +5.1808699462263368e+00 +5.1808699462263368e+00 +0.0000000000000000e+00
37 -7.9652070197993856e+00 -1.3678530683006456e+00 +1.3194707902997481e+01
0 +7.9894655263729337e+00 +7.9894655263729337e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.3079192109021784e+00 +4.3079192109021784e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.6994612424647855e+00 +1.8599910259954902e+00 +3.2105956706140937e-01
24 -2.6450207007250759e+00 +9.1649800665812986e-01 +7.1230374147664115e+00
0 +8.0672259476583825e+00 +8.0672259476583825e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.8390417433521931e+00 -2.2646355300429302e+00 +5.1488124266185258e+00
27 -5.1478127821759161e+00 -9.3669756648219860e-01 +8.4222304313874350e+00
22 -5.3787640703873647e+00 -2.2452162421121695e+00 +6.2670956565503904e+00
19 -4.9270755163282365e+00 -2.4412468788978718e+00 +4.9716572748607293e+00
11 -7.5527317156551721e-01 +3.2127800481695656e-01 +2.1531023527649475e+00
34 -9.7326861951909294e+00 -3.8641865483402396e+00 +1.1736999293701381e+01
7 +3.4370573534335236e-01 +8.4636110915148688e-01 +1.0053107476162690e+00
0 +9.1579976867035899e+00 +9.1579976867035899e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.0657548474270859e+00 -1.4366903896290659e+00 +3.2581289155960400e+00
6 +1.4905869393791882e+00 +1.8569364671224129e+00 +7.3269905548644942e-01
20 -4.7533691964022049e+00 -2.0036888796606687e+00 +5.4993606334830725e+00
0 +6.5689001060417009e+00 +6.5689001060417009e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.2734369999567416e+00 +1.4669346328567707e+00 +3.8699526580005816e-01
18 -4.0665803987877025e+00 -1.8141574089470298e+00 +4.5048459796813454e+00
61 -1.8076896471452937e+01 -5.1584174413133841e+00 +2.5836958060279105e+01
34 -9.6680291278180128e+00 -3.8376039520678789e+00 +1.1660850351500269e+01
18 -4.5809910538677441e+00 -2.3142263856437451e+00 +4.5335293364479980e+00
27 -6.7832548405635267e+00 -2.5082145419282549e+00 +8.5500805972705436e+00
22 -5.0119420619250876e+00 -1.7943739736513118e+00 +6.4351361765475517e+00
22 -3.2503957148659017e+00 -1.2982166271303974e-01 +6.2411481043057240e+00
8 -1.1070152262223116e+00 -5.2758087763691019e-01 +1.1588686971708029e+00
19 -4.1556124181723293e+00 -1.6914792405456889e+00 +4.9282663552532808e+00
24 -3.2125967965563733e+00 +4.2958878203513473e-01 +7.2843711571830161e+00
12 +1.7479348257862339e+00 +3.0494592342751723e+00 +2.6030488169778767e+00
13 -1.7464695742935099e+00 -4.2532447970189047e-01 +2.6422901891832389e+00
7 +2.3582429646482161e+00 +2.8265516907486674e+00 +9.3661745220090253e-01
15 -2.0044696059294962e+00 -3.2647859457769624e-01 +3.3559820227035999e+00
7 +8.2574374593474431e-01 +1.3710672654391503e+00 +1.0906470390088119e+00
14 +1.0237012767835312e+00 +2.5175876783377173e+00 +2.9877728031083723e+00
17 -4.3156278747749353e+00 -2.2163625039747714e+00 +4.1985307416003277e+00
10 +7.2954086491251413e-01 +1.7126318556043429e+00 +1.9661819813836576e+00
3 +2.4794605190934327e-01 +3.5032392610235696e-01 +2.0475574838602739e-01
27 -5.8439244439448599e+00 -1.5663269898684513e+00 +8.5551949081528171e+00
40 -1.1137574562623151e+01 -3.7985169401689682e+00 +1.4678115244908366e+01
0 +1.6801496661963311e+00 +1.6801496661963311e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -4.0764962776957061e+00 +6.5996062886860485e-01 +9.4729138131286224e+00
3 +2.9226104656020002e-01 +3.8939698643363485e-01 +1.9427187974686966e-01
26 -6.2277459864408309e+00 -2.2026280312445961e+00 +8.0502359103924697e+00
0 +1.1342939137802377e+00 +1.1342939137802377e+00 +0.0000000000000000e+00
30 -8.1993469822978753e+00 -3.3742672105811482e+00 +9.6501595434334533e+00
0 +9.0090584866165457e+00 +9.0090584866165457e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.6562441384848610e+00 -1.8183343960361893e+00 +3.6758194848973433e+00
10 -1.2167250225388226e+00 -3.6750483443790927e-01 +1.6984403762018268e+00
15 -3.0373260153821251e+00 -1.2017779877030885e+00 +3.6710960553580732e+00
2 +1.9520515111644343e+00 +1.9879643434253693e+00 +7.1825664521870003e-02
31 -7.1493091456946916e+00 -2.0065701411713968e+00 +1.0285478009046589e+01
42 -9.2049064050707017e+00 -1.4293968878061625e+00 +1.5551019034529078e+01
12 +2.4414917210263187e-01 +1.4020320988817612e+00 +2.3157658535582586e+00
5 +6.1718466002105892e+00 +6.4018741186867789e+00 +4.6005503695237948e-01
8 -2.8612141808991876e-01 +3.5060421220967974e-01 +1.2734512605991970e+00
53 -1.5032064993529087e+01 -4.2749589087925584e+00 +2.1514212169473055e+01
24 -5.1380454661763215e+00 -1.6202186237961440e+00 +7.0356536847603550e+00
40 -1.0578205002273442e+01 -3.1864650212413466e+00 +1.4783479962064192e+01
31 -8.4348763406996348e+00 -3.2967025906724707e+00 +1.0276347500054328e+01
0 +9.2658454990768515e+00 +9.2658454990768515e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -4.0591027470576941e+00 -2.0909653492809666e+00 +3.9362747955534552e+00
26 -7.1628247002456389e+00 -3.1145345928769013e+00 +8.0965802147374752e+00
30 -6.7649698959370435e+00 -1.7527964090463710e+00 +1.0024346973781345e+01
0 +6.9793356884842312e+00 +6.9793356884842312e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +5.2590279943950158e-02 +2.0695440154537259e-01 +3.0872824320284487e-01
22 -5.6134096935082782e+00 -2.5620066965050325e+00 +6.1028059940064914e+00
18 -4.8436798128034768e+00 -2.4188041896939021e+00 +4.8497512462191494e+00
5 +3.6692259447302380e+00 +3.9898124612409527e+00 +6.4117303302142936e-01
14 -9.2775445294261250e-01 +7.2736839326578240e-01 +3.3102456924167898e+00
13 -2.3759622841755332e+00 -9.8643185945662593e-01 +2.7790608494378146e+00
0 +1.6241017795235603e+01 +1.6241017795235603e+01 +0.0000000000000000e+00
26 -5.9054016458285394e+00 -1.8224957472214405e+00 +8.1658117972141984e+00
23 -4.9984850461956443e+00 -1.6401497926451150e+00 +6.7166705071010586e+00
0 +7.5129226836896841e+00 +7.5129226836896841e+00 +0.0000000000000000e+00
22 -4.0102620370443836e+00 -8.5124871628832954e-01 +6.3180266415121080e+00
29 -8.1556119471608284e+00 -3.4055896739873353e+00 +9.5000445463469863e+00
0 +7.4471384811749388e+00 +7.4471384811749388e+00 +0.0000000000000000e+00
1 +3.7761283620488113e+00 +3.7804031509156619e+00 +8.5495777337012413e-03
29 -5.7615216925516437e+00 -1.1357682726179801e+00 +9.2515068398673268e+00
45 -1.2061917076772463e+01 -3.4827073296334641e+00 +1.7158419494278000e+01
0 +5.3284238735247911e+00 +5.3284238735247911e+00 +0.0000000000000000e+00
10 +3.3192291931977902e-01 +1.2852145740725742e+00 +1.9065833095055904e+00
0 +2.4996874065825327e+00 +2.4996874065825327e+00 +0.0000000000000000e+00
20 -4.9450472928655840e+00 -2.1465351568519151e+00 +5.5970242720273378e+00
0 +2.7701219329900315e+00 +2.7701219329900315e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.2341381742849604e+00 -1.0533077531759734e+00 +2.3616608422179741e+00
16 -3.9127706245585268e+00 -1.9813378714355832e+00 +3.8628655062458872e+00
69 -1.9652711829717820e+01 -4.6829290891921396e+00 +2.9939565481051361e+01
28 -7.0324577256860623e+00 -2.5805873988559989e+00 +8.9037406536601260e+00
7 -1.1158255412138685e+00 -6.3653884828805207e-01 +9.5857338585163276e-01
33 -8.2634626957095634e+00 -2.7085944458214541e+00 +1.1109736499776218e+01
41 -1.1721510833728555e+01 -4.1093745741633132e+00 +1.5224272519130484e+01
0 +1.0007869014722477e+01 +1.0007869014722477e+01 +0.0000000000000000e+00
4 +6.8136519632789572e-01 +8.3643803187000731e-01 +3.1014567108422320e-01
13 -3.0187469039146810e+00 -1.6153864694128557e+00 +2.8067208690036507e+00
17 -1.7198409931299148e+00 +4.1263233213331674e-01 +4.2649466505264630e+00
15 -2.8667337454370747e+00 -1.0310576470429731e+00 +3.6713521967882032e+00
1 +2.4793107538627832e+00 +2.4869702474642565e+00 +1.5318987202946666e-02
0 +4.9848524461151200e+00 +4.9848524461151200e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +8.6340637859483405e-01 +9.4938918771875969e-01 +1.7196561824785128e-01
9 +1.0088086734285380e+00 +1.8105889189874613e+00 +1.6035604911178467e+00
27 -6.8253597983466650e+00 -2.6705523863977838e+00 +8.3096148238977623e+00
34 -9.7430834866278992e+00 -3.7863788613151006e+00 +1.1913409250625598e+01
22 -5.1280555966902570e+00 -1.9587816934709794e+00 +6.3385478064385552e+00
7 +1.7954159717864364e+00 +2.2745794362642568e+00 +9.5832692895564087e-01
10 -1.1682525912736983e+00 -2.5065266974520473e-01 +1.8351998430569871e+00
0 +1.1275821204011102e+01 +1.1275821204011102e+01 +0.0000000000000000e+00
1 +3.4162830850641424e+00 +3.4422955902299632e+00 +5.2025010331641752e-02
39 -1.1148521158324918e+01 -3.9515776977605293e+00 +1.4393886921128779e+01
17 -2.5497713556778097e+00 -4.3750478616843358e-01 +4.2245331390187522e+00
55 -1.3819578245377873e+01 -2.4803596210012921e+00 +2.2678437248753163e+01
7 +1.4870220503102693e-01 +6.6439471312166587e-01 +1.0313850161812779e+00
11 -2.3487552775200973e+00 -1.2626544851946759e+00 +2.1722015846508427e+00
33 -7.8986174668557281e+00 -2.3538676267178493e+00 +1.1089499680275757e+01
20 -3.2487275788509615e+00 -5.4585076501833285e-01 +5.4057536276652574e+00
4 +2.7882644524423990e+00 +2.9497785280189301e+00 +3.2302815115306238e-01
0 +8.4524569341844344e+00 +8.4524569341844344e+00 +0.0000000000000000e+00
55 -1.5677974319694485e+01 -4.4387599757307665e+00 +2.2478428687927437e+01
1 +1.2299587398011536e+00 +1.2448423653443985e+00 +2.9767251086489921e-02
6 +4.6252911738378177e-01 +8.7150350612650707e-01 +8.1794877748545058e-01
11 +1.5052578528775218e-01 +1.2030554034542584e+00 +2.1050592363330125e+00
0 +7.9055673277112364e+00 +7.9055673277112364e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.4625969166988799e+00 +4.4625969166988799e+00 +0.0000000000000000e+00
9 -3.5628757725817106e-01 +3.7299913719868716e-01 +1.4585734289137164e+00
5 +7.0833941196300465e-01 +1.0014937665183670e+00 +5.8630870911072464e-01
32 -8.8125408113839896e+00 -3.3325978358297839e+00 +1.0959885951108411e+01
0 +8.1166284126396988e+00 +8.1166284126396988e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.6651103224714943e+00 -1.9467911350686076e+00 +3.4366383748057734e+00
77 -2.0393514919465492e+01 -3.1058885728048145e+00 +3.4575252693321353e+01
48 -1.2975259606282595e+01 -3.6367187058702291e+00 +1.8677081800824730e+01
0 +4.5621895623296069e+00 +4.5621895623296069e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -8.7337191344402409e-01 +1.3674112036559589e+00 +4.4815662341999660e+00
19 -1.2605111160444862e+00 +1.1731289295119289e+00 +4.8672800911128302e+00
4 +9.3230907582650957e-01 +1.0795675423468545e+00 +2.9451693304068982e-01
14 +4.7498685166481547e-01 +2.0186921699222160e+00 +3.0874106365148011e+00
1 +2.8670817192324880e+00 +2.8824565894504848e+00 +3.0749740435993544e-02
28 -6.4898561678369591e+00 -2.0718762408897864e+00 +8.8359598538943445e+00
9 -1.5320222006080035e+00 -7.3176600077733500e-01 +1.6005123996613371e+00
33 -8.9104446139074511e+00 -3.3147540915440823e+00 +1.1191381044726738e+01
11 -2.3775640650937069e+00 -1.3330856987146316e+00 +2.0889567327581506e+00
0 +3.9394490545475542e+00 +3.9394490545475542e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.6931534148690481e+00 +3.6931534148690481e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +4.5491982020235620e+00 +4.5491982020235620e+00 +0.0000000000000000e+00
11 +5.8277351207702299e-01 +1.6211837947625440e+00 +2.0768205653710421e+00
19 -5.1166680947638943e+00 -2.5067593009437448e+00 +5.2198175876402990e+00
13 -1.5936332973412881e+00 -1.9818304528242958e-01 +2.7909005041177171e+00
8 +2.0192657550744171e+00 +2.6952209503824927e+00 +1.3519103906161511e+00
9 -1.6333214106416500e+00 -9.1645142170341565e-01 +1.4337399778764688e+00
0 +7.1992414857340439e+00 +7.1992414857340439e+00 +0.0000000000000000e+00
42 -1.1930407577843162e+01 -4.0251564655581031e+00 +1.5810502224570119e+01
18 -1.6980743004296910e+00 +5.5729839541882553e-01 +4.5107453916970330e+00
9 -1.4153675369098666e+00 -7.0744727248410744e-01 +1.4158405288515183e+00
34 -5.8119153930634555e+00 -9.4659302805575329e-03 +1.1604898925565795e+01
12 -9.0976401549334973e-01 +2.5610132737942104e-01 +2.3317306857455415e+00
0 +5.0462662963898470e+00 +5.0462662963898470e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +1.7692016395967274e+00 +1.8911374156083123e+00 +2.4387155202316979e-01
23 -4.8758885993192704e+00 -1.4702092341145985e+00 +6.8113587304093439e+00
49 -1.2756810811704316e+01 -3.0498342580905136e+00 +1.9413953107227606e+01
9 -1.5125087091571059e+00 -6.8656518118429410e-01 +1.6518870559456236e+00
0 +2.5028101683220534e+00 +2.5028101683220534e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.9613318318116422e+00 +3.9613318318116422e+00 +0.0000000000000000e+00
6 +9.0626411865879053e-01 +1.2721672233011105e+00 +7.3180620928464002e-01
7 +4.5032793092458956e-01 +9.2994774373998546e-01 +9.5923962563079179e-01
13 -7.4274881867796072e-01 +7.0113257966750231e-01 +2.8877627966909261e+00
3 +1.9618010349570003e+00 +2.1044613307896056e+00 +2.8532059166521062e-01
20 -4.4984236817792231e+00 -1.8438603504415574e+00 +5.3091266626753315e+00
3 +2.8111152000224466e+00 +2.8954942809569681e+00 +1.6875816186904302e-01
48 -1.2875339594053603e+01 -3.5550369237153721e+00 +1.8640605340676462e+01
31 -7.4475551488201619e+00 -2.2297698528057626e+00 +1.0435570592028800e+01
0 +1.0708802339044675e+01 +1.0708802339044675e+01 +0.0000000000000000e+00
49 -1.4164639409523019e+01 -4.4742299910288761e+00 +1.9380818836988286e+01
13 -2.5531096090225978e+00 -1.1866818013306548e+00 +2.7328556153838859e+00
9 +1.5400485935467314e+00 +2.2917983987788180e+00 +1.5034996104641731e+00
4 +1.3038704485087891e+00 +1.5218566985537603e+00 +4.3597250008994237e-01
34 -8.9826033956487912e+00 -3.0569908395085039e+00 +1.1851225112280574e+01
12 -1.4555302171686941e+00 -2.1839859617160506e-01 +2.4742632419941781e+00
3 +5.3383730212605212e+00 +5.4188914827957753e+00 +1.6103692307050821e-01
10 +1.5668113713457634e+00 +2.5235708407496764e+00 +1.9135189388078260e+00
0 +5.2449981298897388e+00 +5.2449981298897388e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.8951089505432597e+00 -2.4251723613561853e+00 +4.9398731783741487e+00
40 -1.1170095667779687e+01 -3.7859092424088021e+00 +1.4768372850741770e+01
10 -1.1818172368565500e+00 -3.1347516937784192e-01 +1.7366841349574162e+00
22 -5.9918726498352681e+00 -2.8144751612294137e+00 +6.3547949772117089e+00
8 +2.0629095399415140e+00 +2.6978767058635240e+00 +1.2699343318440199e+00
36 -6.9518706921337872e+00 -6.9350647247026376e-01 +1.2516728439327046e+01
14 -2.8497547800503940e+00 -1.2822766202913853e+00 +3.1349563195180172e+00
19 -4.1244700819884494e+00 -1.6564447189872120e+00 +4.9360507260024749e+00
55 -1.6463282118774575e+01 -5.1920760335504372e+00 +2.2542412170448276e+01
1 +1.2728307354678590e+00 +1.2789540196404552e+00 +1.2246568345192443e-02
20 -2.4725023009738516e+00 +2.5798031758286966e-01 +5.4609652371134425e+00
0 +4.2330275850623700e+00 +4.2330275850623700e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.8825769469412181e+00 -2.0333929371194137e+00 +3.6983680196436088e+00
37 -9.0014580857139990e+00 -2.3399465560015891e+00 +1.3323023059424820e+01
13 -3.8667810212958020e-01 +1.0043879732262222e+00 +2.7821321507116048e+00
45 -1.2551055474937836e+01 -4.0438596623218919e+00 +1.7014391625231887e+01
10 +9.4798113162245823e-01 +1.8963204920505141e+00 +1.8966787208561118e+00
17 -2.9633092323309009e+00 -8.1487551247154233e-01 +4.2968674397187172e+00
0 +4.0533995745132003e+00 +4.0533995745132003e+00 +0.0000000000000000e+00
45 -1.3118072806006193e+01 -4.4089087019694277e+00 +1.7418328208073532e+01
5 +5.1732695557213670e-01 +7.8804542504946706e-01 +5.4143693895466072e-01
3 +2.4818583856696179e+00 +2.6129538994540908e+00 +2.6219102756894586e-01
23 -5.9984094318614423e+00 -2.5973860399836113e+00 +6.8020467837556620e+00
2 +4.3364707057325775e+00 +4.3680586328552291e+00 +6.3175854245303142e-02
12 -2.4576076429031319e+00 -1.1558287557772848e+00 +2.6035577742516942e+00
23 -5.8632830408067056e+00 -2.5549390285986595e+00 +6.6166880244160922e+00
30 -4.8716448832339365e+00 +1.4794362713594067e-01 +1.0039177020739753e+01
31 -8.4455896345651595e+00 -3.3178818893509838e+00 +1.0255415490428351e+01
18 -4.5795898366986076e-01 +1.8264906026284233e+00 +4.5688991725965682e+00
10 -4.1123087580960682e-01 +5.0366979062909634e-01 +1.8298013328774063e+00
0 +4.4769168636936856e+00 +4.4769168636936856e+00 +0.0000000000000000e+00
12 -2.2090521365110236e+00 -9.4928583424014512e-01 +2.5195326045417570e+00
4 +2.7316384922041603e-01 +4.6856027819493118e-01 +3.9079285794903029e-01
0 +2.8588048411063118e+00 +2.8588048411063118e+00 +0.0000000000000000e+00
30 -8.1081010337657915e+00 -3.2549629712393071e+00 +9.7062761250529697e+00
23 -5.8466112434689714e+00 -2.5444395796438597e+00 +6.6043433276502235e+00
11 -1.9074569553872296e+00 -8.4853114360419735e-01 +2.1178516235660645e+00
2 +2.5481638124093609e+00 +2.5921134424736243e+00 +8.7899260128526890e-02
0 +1.8347225884673710e+00 +1.8347225884673710e+00 +0.0000000000000000e+00
18 -4.6966773592481159e+00 -2.3218252004368392e+00 +4.7497043176225535e+00
20 -5.1716831697227859e+00 -2.4718199859407233e+00 +5.3997263675641252e+00
11 -4.5146263037694911e-01 +6.5683852072683990e-01 +2.2166023022075780e+00
5 +3.9738041182832440e-01 +6.7980175085384253e-01 +5.6484267805103627e-01
7 +2.3101843179278339e+00 +2.8314991904429139e+00 +1.0426297450301600e+00
37 -1.0470852889196660e+01 -3.8919139448468973e+00 +1.3157877888699526e+01
35 -9.8562008017843326e+00 -3.6451417813865437e+00 +1.2422118040795578e+01
11 -1.6959910497990114e+00 -6.4551644323921931e-01 +2.1009492131195842e+00
0 +3.9318670709712862e+00 +3.9318670709712862e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -8.7930134648559388e-01 -4.2588998537352918e-01 +9.0682272222412941e-01
0 +2.7464274339743793e+00 +2.7464274339743793e+00 +0.0000000000000000e+00
10 -1.8682938863855449e+00 -9.6016972687289570e-01 +1.8162483190252985e+00
31 -8.2037010285415946e+00 -2.9209054499151055e+00 +1.0565591157252978e+01
7 +1.4794671117221814e-01 +6.7182568747255411e-01 +1.0477579526006719e+00
57 -1.5629087008565456e+01 -3.8191939191253814e+00 +2.3619786178880148e+01
15 -3.4611223885142950e+00 -1.7340742577665931e+00 +3.4540962614954038e+00
0 +3.3084809975672820e+00 +3.3084809975672820e+00 +0.0000000000000000e+00
8 +9.1956112559947023e-01 +1.4970139489699039e+00 +1.1549056467408674e+00
4 +5.1875822961447966e+00 +5.3395367519763965e+00 +3.0390891166319989e-01
0 +5.2765435967210026e+00 +5.2765435967210026e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -3.2774349847268356e+00 -7.5684900695892843e-01 +5.0411719555358143e+00
14 +6.2770350795889751e-01 +2.1464524142509207e+00 +3.0374978125840464e+00
18 -4.0905794598725533e+00 -1.6764096042206686e+00 +4.8283397113037694e+00
4 +3.0452019387247526e+00 +3.2125296710162008e+00 +3.3465546458289630e-01
9 +1.6995950692755901e-01 +8.8303163846306809e-01 +1.4261442630710182e+00
9 -8.1948190423220790e-01 -6.0519699961781193e-02 +1.5179244085408534e+00
14 -1.7664465049220928e+00 -2.1373644873053577e-01 +3.1054201123831140e+00
14 -2.7922337397531907e+00 -1.1267147181393820e+00 +3.3310380432276174e+00
0 +5.8341128408280047e+00 +5.8341128408280047e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +3.4051697528497287e+00 +3.6209439704249360e+00 +4.3154843515041463e-01
26 -6.3917171694064328e+00 -2.3972711206538868e+00 +7.9888920975050919e+00
14 -2.6940646696950212e+00 -1.0970375935167680e+00 +3.1940541523565065e+00
39 -9.0702587091452926e+00 -2.0766193862730531e+00 +1.3987278645744478e+01
26 -7.1398515612173670e+00 -3.0731359949407500e+00 +8.1334311325532340e+00
23 -2.1435919336171709e+00 +1.2139630014108649e+00 +6.7151098700560716e+00
14 +8.3152494872247207e-01 +2.4648694384051333e+00 +3.2666889793653224e+00
50 -1.4701505945631791e+01 -4.8796170984445908e+00 +1.9643777694374400e+01
41 -1.2102583645907476e+01 -4.4263361316449661e+00 +1.5352495028525020e+01
1 +4.4064367281955654e+00 +4.4265103979095866e+00 +4.0147339428042272e-02
0 +8.9867244062009135e+00 +8.9867244062009135e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.1027765024735636e+00 +8.1027765024735636e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +1.0334733575645906e+01 +1.0334733575645906e+01 +0.0000000000000000e+00
9 +1.5417461744618777e-02 +7.1634615143164826e-01 +1.4018573793740590e+00
15 -1.7377667294122556e-01 +1.5951831426700234e+00 +3.5379196312224979e+00
14 -3.4935448623071332e+00 -1.8572495066751711e+00 +3.2725907112639243e+00
16 -4.0721389381915367e+00 -2.1110238546278213e+00 +3.9222301671274309e+00
38 -8.1108211245507214e+00 -1.1752961673168221e+00 +1.3871049914467799e+01
0 +1.0145952104298148e+00 +1.0145952104298148e+00 +0.0000000000000000e+00
15 +3.7296058896302497e-02 +1.7191107454021650e+00 +3.3636293730117250e+00
16 +1.2587265561794858e-01 +2.0461160029146055e+00 +3.8404866945933138e+00
6 +1.4584232503986314e+00 +1.8772178008406639e+00 +8.3758910088406502e-01
16 -1.9724023820268881e+00 +1.5058630469395595e-03 +3.9478164901476553e+00
75 -2.1970948717560454e+01 -5.2235924879961635e+00 +3.3494712459128579e+01
4 +3.3528036279144358e+00 +3.5453306702156042e+00 +3.8505408460233692e-01
0 +4.1947518312403842e+00 +4.1947518312403842e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +3.3274375054704439e+00 +3.4833265440782606e+00 +3.1177807721563333e-01
15 -3.3528302154803145e+00 -1.6370310106515595e+00 +3.4315984096575098e+00
20 -1.5350500309971089e+00 +1.2690019362884244e+00 +5.6081039345710666e+00
24 -5.3283640584812213e+00 -1.8428002128399261e+00 +6.9711276912825904e+00
1 +2.7776283050326236e+00 +2.7912094292476399e+00 +2.7162248430032676e-02
0 +5.9344313541188773e+00 +5.9344313541188773e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +3.9631879574931430e+00 +4.0089978511033584e+00 +9.1619787220430737e-02
12 -2.5657256696112185e-02 +1.1720637785170673e+00 +2.3954420704263590e+00
0 +4.9903813675725637e+00 +4.9903813675725637e+00 +0.0000000000000000e+00
13 +5.9616777216159278e-01 +2.0340647429909700e+00 +2.8757939416587543e+00
36 -9.5587490489113129e+00 -3.0928777854114502e+00 +1.2931742526999725e+01
12 -1.7914604834601162e+00 -5.6620970928722603e-01 +2.4505015483457804e+00
0 +3.0418336721740031e+00 +3.0418336721740031e+00 +0.0000000000000000e+00
21 -4.2016862518572156e+00 -1.3435467746032597e+00 +5.7162789545079118e+00
37 -1.0631362920761756e+01 -4.0035099648952439e+00 +1.3255705911733024e+01
32 -7.4275908750221289e+00 -1.9586532657080042e+00 +1.0937875218628250e+01
17 -2.2121019431336508e+00 -1.7040655021206952e-01 +4.0833907858431626e+00
2 +4.6946832728637471e+00 +4.7672367142483036e+00 +1.4510688276911310e-01
6 +1.2708017153601325e-01 +5.4859815559424163e-01 +8.4303596811645676e-01
45 -1.3236581271723416e+01 -4.6444173734504135e+00 +1.7184327796546008e+01
26 -5.8537713333596679e+00 -1.7716585364848660e+00 +8.1642255937496042e+00
0 +8.2865561409936923e+00 +8.2865561409936923e+00 +0.0000000000000000e+00
9 +2.0152656389704049e-01 +1.0077336318612446e+00 +1.6124141359284083e+00
0 +9.1576384494036489e+00 +9.1576384494036489e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +5.2778613879446734e+00 +5.2778613879446734e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.3865080038918318e+00 +8.3865080038918318e+00 +0.0000000000000000e+00
35 -7.0672614869466939e+00 -1.0011053197755144e+00 +1.2132312334342359e+01
25 -6.9624862915677950e+00 -3.1296001040911823e+00 +7.6657723749532254e+00
5 +2.6147451142575404e+00 +2.9372776023019069e+00 +6.4506497608873303e-01
44 -1.2888558679393984e+01 -4.4481717246469454e+00 +1.6880773909494078e+01
1 +5.3557108601699746e+00 +5.3772882296900200e+00 +4.3154739040090817e-02
17 -3.6285463811251004e+00 -1.4178465905368522e+00 +4.4213995811764963e+00
7 -1.1883726335087914e+00 -6.4167067530370847e-01 +1.0934039164101659e+00
27 -7.4739725004672222e+00 -3.1870339232902163e+00 +8.5738771543540118e+00
6 +1.5713776267190322e+00 +2.0062241064083048e+00 +8.6969295937854518e-01
0 +8.6577822294156483e+00 +8.6577822294156483e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +8.6725846685316412e+00 +8.6725846685316412e+00 +0.0000000000000000e+00
26 -5.9674837172270179e+00 -1.9368638978932713e+00 +8.0612396386674927e+00
25 -6.3627600182765081e+00 -2.5799923549040762e+00 +7.5655353267448637e+00
0 +7.2918495751543810e+00 +7.2918495751543810e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -5.5082657596758429e+00 -1.1648727789715818e-01 +1.0783556963557370e+01
1 +1.7408939937605199e+00 +1.7549359661301880e+00 +2.8083944739336175e-02
8 -2.2446545676376051e-01 +3.7489598199102403e-01 +1.1987228775095691e+00
6 -1.3059013430527955e-01 +2.0438462535739443e-01 +6.6994951932534796e-01
23 -6.0563411619124254e+00 -2.7851944537816786e+00 +6.5422934162614936e+00
36 -8.9394781405974193e+00 -2.4854484687856662e+00 +1.2908059343623506e+01
14 -2.0532390012168067e+00 -4.3440336103975064e-01 +3.2376712803541121e+00
18 -9.7040125859675630e-01 +1.4318015596466713e+00 +4.8044056364868553e+00
0 +5.9348068771093008e+00 +5.9348068771093008e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +2.4860399108909323e+00 +2.6251051837486195e+00 +2.7813054571537421e-01
10 -1.9425517685685874e+00 -1.0979129762713891e+00 +1.6892775845943966e+00
17 -3.1735710466741134e+00 -9.9668536490597504e-01 +4.3537713635362767e+00
0 +2.9729277372457172e+00 +2.9729277372457172e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +2.1224137121932136e+00 +2.1224137121932136e+00 +0.0000000000000000e+00
8 -1.4432705103974959e+00 -7.5556252027973514e-01 +1.3754159802355215e+00
0 +2.8198225754205208e+00 +2.8198225754205208e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +3.0766280495424301e+00 +3.1183290827821004e+00 +8.3402066479340675e-02
21 -2.2283188514561738e+00 +6.5873312358973912e-01 +5.7741039500918259e+00
32 -8.8805829705582653e+00 -3.3863055968243243e+00 +1.0988554747467882e+01
15 -3.7462416183166267e+00 -1.9087095261159548e+00 +3.6750641844013439e+00
4 -1.7853472506826851e-01 +3.1203571035507416e-02 +4.1947659220755185e-01
0 +6.9307126172558204e+00 +6.9307126172558204e+00 +0.0000000000000000e+00
28 -7.3114158111792440e+00 -2.8476763769064708e+00 +8.9274788685455455e+00
11 -8.6342060912508778e-01 +2.8160750764090769e-01 +2.2900562335319909e+00
46 -1.3384944791846340e+01 -4.4353212974066611e+00 +1.7899246988879359e+01
7 -1.2616484436311781e+00 -7.2423128779810408e-01 +1.0748343116661481e+00
61 -1.7493163904079847e+01 -4.6269234802714037e+00 +2.5732480847616884e+01
7 +1.1904908785758410e+00 +1.6608499663320977e+00 +9.4071817551251335e-01
7 -3.9049920888070755e-01 +9.0015236075583260e-02 +9.6102888991258162e-01
11 -1.9069179199785404e+00 -7.7011577082356375e-01 +2.2736042983099534e+00
6 -8.2338871425090865e-01 -4.3712582532323374e-01 +7.7252577785534982e-01
0 +7.8192280646783905e+00 +7.8192280646783905e+00 +0.0000000000000000e+00
17 -2.4166833887066907e-01 +1.9696455478420720e+00 +4.4226277734254822e+00
32 -8.2080590633586148e+00 -2.7580862527835661e+00 +1.0899945621150097e+01
11 -2.4366851116728760e-02 +1.0935916080582508e+00 +2.2359169183499592e+00
66 -1.8010334599378030e+01 -3.7565661757878255e+00 +2.8507536847180411e+01
6 -6.6511707301931899e-01 -2.6258595298839094e-01 +8.0506224006185612e-01
6 +1.9981054245794079e+00 +2.4319433865067794e+00 +8.6767592385474313e-01
1 +2.0177973655086952e+00 +2.0181000133975653e+00 +6.0529577774026677e-04
0 +3.8125352574492908e+00 +3.8125352574492908e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -2.7420984139514735e+00 -2.1820206047519530e-01 +5.0477927069525563e+00
6 +1.6302054158183008e+00 +2.0140500296027621e+00 +7.6768922756892266e-01
16 -3.0086630429773580e+00 -1.0105208340296499e+00 +3.9962844178954162e+00
11 -8.3861797313990571e-01 +2.0335173413878582e-01 +2.0839394145573831e+00
0 +8.0197274799324862e+00 +8.0197274799324862e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +3.1520147818649904e+00 +3.1520147818649904e+00 +0.0000000000000000e+00
32 -8.0414325899149333e+00 -2.5705320464494061e+00 +1.0941801086931054e+01
9 +8.0099200560498218e-01 +1.6002258558789277e+00 +1.5984677005478911e+00
9 -3.9606562041174342e-01 +3.1651741928229482e-01 +1.4251660793880765e+00
10 -6.7692521114504522e-01 +1.7556501308430139e-01 +1.7049804484586932e+00
22 -5.5139782619688686e+00 -2.2674717766008623e+00 +6.4930129707360127e+00
14 -2.7293657983873212e+00 -1.1787781960535493e+00 +3.1011752046675438e+00
0 +8.5265069572592136e+00 +8.5265069572592136e+00 +0.0000000000000000e+00
29 -8.0081462664197538e+00 -3.2721545100397957e+00 +9.4719835127599161e+00
48 -1.4094738123217585e+01 -4.6440837967052300e+00 +1.8901308653024710e+01
18 -4.1846417793538437e+00 -1.8571022664693730e+00 +4.6550790257689414e+00
1 +3.1495071189803574e+00 +3.1633321859537635e+00 +2.7650133946812261e-02
2 +2.0947911550302099e+00 +2.1462791899287694e+00 +1.0297606979711915e-01
23 -5.2744851089004774e+00 -1.8031782185381178e+00 +6.9426137807247192e+00
37 -9.0198324808299155e+00 -2.3187018023130550e+00 +1.3402261357033721e+01
8 -9.1421064334631108e-01 -2.2300249667163996e-01 +1.3824162933493422e+00
0 +9.0032587352088651e+00 +9.0032587352088651e+00 +0.0000000000000000e+00
15 -3.8729372725225817e+00 -2.0300046009165462e+00 +3.6858653432120709e+00
17 -1.4379735105542659e+00 +7.1057672731649113e-01 +4.2971004757415141e+00
13 +2.4689600782300136e-01 +1.6068071460405191e+00 +2.7198222764350355e+00
9 +7.4490871018882387e-01 +1.4627431437022280e+00 +1.4356688670268083e+00
0 +4.0530693702658365e+00 +4.0530693702658365e+00 +0.0000000000000000e+00
2 +4.5037872921976803e+00 +4.5478622009225571e+00 +8.8149817449753698e-02
1 +4.7273723360456783e+00 +4.7350883615608428e+00 +1.5432051030328964e-02
0 +7.9625994227257877e+00 +7.9625994227257877e+00 +0.0000000000000000e+00
11 -1.7313232734467148e+00 -5.9405060743906368e-01 +2.2745453320153022e+00
43 -1.0299574469612846e+01 -2.2203553868333179e+00 +1.6158438165559055e+01
0 +9.6571174727155196e+00 +9.6571174727155196e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +1.7728727415970971e+00 +1.9714518344807979e+00 +3.9715818576740158e-01
4 +1.1842111073876183e+00 +1.3644682488910296e+00 +3.6051428300682264e-01
22 -5.0307987589875180e+00 -1.8599746590858324e+00 +6.3416481998033714e+00
20 -5.3686776668076037e+00 -2.5455333979853401e+00 +5.6462885376445273e+00
2 +1.5502702192664524e+00 +1.6202637532078579e+00 +1.3998706788281101e-01
0 +1.0642236980111829e+01 +1.0642236980111829e+01 +0.0000000000000000e+00
0 +3.4635440552935268e+00 +3.4635440552935268e+00 +0.0000000000000000e+00
4 +4.1600976272565049e-01 +6.1782161027743232e-01 +4.0362369510356366e-01
5 +1.4947756755453714e+00 +1.7239131382137045e+00 +4.5827492533666625e-01
20 -5.2531426979210680e+00 -2.4843281450440426e+00 +5.5376291057540508e+00
1 +2.7272397826980281e+00 +2.7382466272906059e+00 +2.2013689185155449e-02
0 +6.0557890720014882e+00 +6.0557890720014882e+00 +0.0000000000000000e+00
19 -4.6014922425727969e+00 -2.0384262959278696e+00 +5.1261318932898545e+00
20 -3.8057172786430309e+00 -1.1456446067909378e+00 +5.3201453437041861e+00
0 +1.8098891381812493e+01 +1.8098891381812493e+01 +0.0000000000000000e+00
10 -1.5625678895796176e+00 -6.0035333191620222e-01 +1.9244291153268307e+00
0 +9.0527305385293513e+00 +9.0527305385293513e+00 +0.0000000000000000e+00
0 +6.6194567168035965e+00 +6.6194567168035965e+00 +0.0000000000000000e+00
14 -3.2749736255292339e+00 -1.7482370469981441e+00 +3.0534731570621796e+00
0 +1.4240145332426010e+01 +1.4240145332426010e+01 +0.0000000000000000e+00
9 +4.4836560403905068e-01 +1.2085759993904110e+00 +1.5204207907027207e+00
10 +1.8490224308647703e+00 +2.7390945659647916e+00 +1.7801442702000427e+00
14 -2.5636633572948488e+00 -8.9892401962482049e-01 +3.3294786753400567e+00
3 +6.0329605355001448e-01 +6.8873674221134440e-01 +1.7088137732265984e-01
0 +7.2851955742482133e+00 +7.2851955742482133e+00 +0.0000000000000000e+00
27 -7.5073630636063440e+00 -3.2878159709477179e+00 +8.4390941853172521e+00
53 -1.5228802612857443e+01 -4.4989474502093705e+00 +2.1459710325296143e+01
60 -1.3857935431845679e+01 -1.2518816701888840e+00 +2.5212107523313591e+01
18 -2.4630868344486840e+00 -4.3782017887909142e-02 +4.8386096331215498e+00
16 -3.9533522246097368e+00 -2.0531090803237086e+00 +3.8004862885720563e+00
12 -1.6854276380018298e+00 -5.2967883625208056e-01 +2.3114976034994985e+00
1 +2.0542830848622540e+00 +2.0545836394336447e+00 +6.0110914278155292e-04
16 -3.7661841155831182e+00 -1.8710531079649426e+00 +3.7902620152363511e+00
7 -1.2117863548624426e+00 -6.9271643073303046e-01 +1.0381398482588242e+00
0 +5.5388459225445761e+00 +5.5388459225445761e+00 +0.0000000000000000e+00
12 +2.2917700406133790e-01 +1.4614931198962697e+00 +2.4646322316698637e+00
9 -1.0420815290240784e+00 -2.3695263919708243e-01 +1.6102577796539919e+00
5 +2.4926751645930256e-01 +5.4622385712212385e-01 +5.9391268132564257e-01
7 +1.2642714155331563e+00 +1.7934697269694531e+00 +1.0583966228725936e+00
8 +1.8162962309760804e+00 +2.4094157896311215e+00 +1.1862391173100821e+00
2 +3.3935128712235656e+00 +3.4244026819989255e+00 +6.1779621550719810e-02
6 +2.6356776187010320e+00 +3.0401209464692878e+00 +8.0888665553651151e-01
42 -9.6635419467510566e+00 -1.8899486407670096e+00 +1.5547186611968094e+01
0 +1.7169166488344834e+00 +1.7169166488344834e+00 +0.0000000000000000e+00
40 -1.1503426074624933e+01 -4.2648499345908579e+00 +1.4477152280068150e+01
15 -2.7783214809643697e+00 -9.2806121524981267e-01 +3.7005205314291141e+00
32 -8.4119278030289450e+00 -3.0801246735572709e+00 +1.0663606258943348e+01
14 -2.6741886531523500e+00 -1.1419938846427171e+00 +3.0643895370192658e+00
0 +3.0493441760089071e+00 +3.0493441760089071e+00 +0.0000000000000000e+00
16 -3.4109693312401914e+00 -1.5577239598797785e+00 +3.7064907427208258e+00
23 -4.4102829262998133e+00 -1.0134617131576955e+00 +6.7936424262842356e+00
1 +3.6587034597741037e+00 +3.6602182485300427e+00 +3.0295775118780455e-03
53 -1.5795554820464250e+01 -5.1276481062857195e+00 +2.1335813428357064e+01
13 -2.8229514139038878e+00 -1.3707123122499030e+00 +2.9044782033079697e+00
6 +2.7320017725957011e+00 +3.1359563115599740e+00 +8.0790907792854583e-01
9 -5.9055297976596410e-01 +1.3092817989433625e-01 +1.4429623193206007e+00
64 -1.9272420747142046e+01 -5.6495962809714886e+00 +2.7245648932341116e+01
30 -8.3841162255011454e+00 -3.5115020957055525e+00 +9.7452282595911868e+00
0 +4.9303205511662309e+00 +4.9303205511662309e+00 +0.0000000000000000e+00
3 +5.9126050576346678e-02 +1.9441512634600233e-01 +2.7057815153931131e-01
18 -4.5149886900451941e+00 -2.2431469725630535e+00 +4.5436834349642812e+00
13 -2.4245235653475161e+00 -1.0802754983647929e+00 +2.6884961339654465e+00
24 -5.0494570189109007e+00 -1.3910919097306973e+00 +7.3167302183604068e+00
33 -9.6262202004049975e+00 -3.8607104539457202e+00 +1.1531019492918555e+01
21 -3.4677272160704726e+00 -4.3960773606530834e-01 +6.0562389600103286e+00
16 -3.8515849453957189e+00 -1.8119831116421308e+00 +4.0792036675071763e+00
0 +1.0252618758200164e+01 +1.0252618758200164e+01 +0.0000000000000000e+00
12 +1.4804407258743879e-03 +1.2551046642096759e+00 +2.5072484469676031e+00
24 -5.6715151516408211e+00 -2.1391391038283860e+00 +7.0647520956248702e+00
3 +3.8670364180708550e-01 +5.2690401573018075e-01 +2.8040074784619051e-01
20 -2.2200711233512207e+00 +4.8436950249809474e-01 +5.4088812516986309e+00
8 +2.8659974302632536e+00 +3.5041714515695435e+00 +1.2763480426125797e+00
0 +7.5067424980768891e+00 +7.5067424980768891e+00 +0.0000000000000000e+00
24 -4.4935825394848292e+00 -9.4564308501180117e-01 +7.0958789089460561e+00
0 +1.1852268060489816e+01 +1.1852268060489816e+01 +0.0000000000000000e+00
19 -4.2596617933111736e+00 -1.7929675919393584e+00 +4.9333884027436303e+00
24 -5.8103001097385638e+00 -2.2279979431750929e+00 +7.1646043331269418e+00
0 +3.7730692567231015e+00 +3.7730692567231015e+00 +0.0000000000000000e+00
34 -9.1660679809248045e+00 -3.1936543440271739e+00 +1.1944827273795262e+01
0 +7.6156312451773633e+00 +7.6156312451773633e+00 +0.0000000000000000e+00
7 +7.7476584194816311e-01 +1.2804168532511366e+00 +1.0113020226059470e+00
66 -1.9193914029840947e+01 -5.0180103907784215e+00 +2.8351807278125051e+01
35 -9.1184981344779921e+00 -2.9995376309686153e+00 +1.2237921007018754e+01
10 -3.2543046460966707e-01 +5.4929847158594880e-01 +1.7494578723912317e+00
11 -1.4883095690307950e+00 -4.0240550361000782e-01 +2.1718081308415744e+00
4 +3.3838059368968976e+00 +3.6079446997598983e+00 +4.4827752572600144e-01
2 +2.4166737792546176e+00 +2.4478668159908925e+00 +6.2386073472549874e-02
21 -4.5505383385876561e+00 -1.6890358644772241e+00 +5.7230049482208640e+00
4 +1.3219407407318320e+00 +1.5388226830810616e+00 +4.3376388469845928e-01
23 -6.1861280216256960e+00 -2.8871738216192373e+00 +6.5979084000129173e+00
16 -4.0919813324748526e+00 -2.0576574102701040e+00 +4.0686478444094973e+00
6 +2.1510897595973923e+00 +2.5256057859288292e+00 +7.4903205266287376e-01
57 -1.5785255071167224e+01 -3.9331900434010856e+00 +2.3704130055532278e+01
2 +5.9283661405512635e+00 +5.9622026717169057e+00 +6.7673062331284228e-02
12 -2.4556951400947202e-01 +1.0680445495211344e+00 +2.6272281270612128e+00
22 -5.6593660030440249e+00 -2.5101203540106987e+00 +6.2984912980666525e+00
25 -4.3050937447952853e+00 -5.3954016904012647e-01 +7.5311071515103176e+00
4 -2.4796385431868639e-01 -2.7671503265270125e-02 +4.4058470210683254e-01
36 -9.7914435537315327e+00 -3.4038736578864572e+00 +1.2775139791690151e+01
0 +4.1573956029153445e+00 +4.1573956029153445e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -9.0866362094901802e+00 -3.5528358593916689e+00 +1.1067600700197023e+01
12 -2.9247460876881624e+00 -1.6069265891571369e+00 +2.6356389970620508e+00
2 +2.4743389042754433e+00 +2.5409570503769761e+00 +1.3323629220306543e-01
0 +4.4165068661571478e+00 +4.4165068661571478e+00 +0.0000000000000000e+00
33 -7.1926097785476601e+00 -1.4773200650468590e+00 +1.1430579427001602e+01
0 +8.5830464146819896e+00 +8.5830464146819896e+00 +0.0000000000000000e+00
7 -6.7897005907472963e-01 -1.3863047059986489e-01 +1.0806791769497295e+00
18 -3.1527383894544796e+00 -8.1724021464175767e-01 +4.6709963496254439e+00
9 -1.2632044086920375e+00 -5.3811920339399322e-01 +1.4501704105960886e+00
7 -1.2920813296765070e+00 -7.4364282468401122e-01 +1.0968770099849916e+00
5 +1.7784632561064146e+00 +2.0943649018171886e+00 +6.3180329142154790e-01
34 -6.9825634408405017e+00 -1.1295644165890883e+00 +1.1705998048502828e+01
4 +2.7962281252140104e+00 +2.9401449110695155e+00 +2.8783357171101009e-01
13 -2.1350311339610046e+00 -7.5639032005264673e-01 +2.7572816278167158e+00
12 -2.8017280866488230e+00 -1.5582336142532869e+00 +2.4869889447910722e+00
29 -8.1029720743991405e+00 -3.3701699009386372e+00 +9.4656043469210065e+00
53 -1.2639692634556390e+01 -1.9278558330662245e+00 +2.1423673602980330e+01
13 -2.9519274153309043e+00 -1.6248246204261281e+00 +2.6542055898095525e+00
30 -5.4759760062346823e+00 -5.8318312048765142e-01 +9.7855857714940626e+00
27 -7.5659395749576310e+00 -3.3046098888655884e+00 +8.5226593721840853e+00
3 +1.0607688560987381e+00 +1.1632120042586500e+00 +2.0488629631982391e-01
35 -8.3255160437259228e+00 -2.2669109939663485e+00 +1.2117210099519149e+01
1 +1.0698250538038332e+00 +1.0740553956518770e+00 +8.4606836960876564e-03
12 -1.2903083462656237e+00 -2.7067517216144754e-02 +2.5264816580989580e+00
11 -1.9505350581411216e+00 -8.3689645621326569e-01 +2.2272772038557118e+00
5 +4.1152785929389157e+00 +4.4291705578995000e+00 +6.2778392992116849e-01
3 +1.8983482746089138e+00 +2.0261979849422005e+00 +2.5569942066657347e-01
32 -6.2153585498593289e+00 -7.3216012276457954e-01 +1.0966396854189499e+01
12 -1.5728538161995251e+00 -3.8209802044332042e-01 +2.3815115915124094e+00
56 -1.6895587981619226e+01 -5.3133396955300451e+00 +2.3164496572178361e+01
34 -9.6178072631869220e+00 -3.8482569331397216e+00 +1.1539100660094402e+01
24 -6.4587897582665983e+00 -2.9755974867823936e+00 +6.9663845429684095e+00
39 -1.0452278969794598e+01 -3.3283478061374123e+00 +1.4247862327314373e+01
32 -6.5337094352887961e+00 -1.1598815022864788e+00 +1.0747655866004635e+01
23 -4.5547492019749596e+00 -1.1561160795702836e+00 +6.7972662448093519e+00
49 -1.3067942742966004e+01 -3.4109731354977577e+00 +1.9313939214936493e+01
5 +2.1628880855462365e+00 +2.4208812668830455e+00 +5.1598636267361808e-01
15 -3.8263977977819925e+00 -1.9774429250217591e+00 +3.6979097455204668e+00

Две новые модели для калькулятора DIYDodecad

Закончил на 99% подготовку 2 моделей этно-популяционных калькуляторов ДНК — заточенную под deep ancestry (анализ современных геномов с использование древних геномов) K11 и модель для анализа популяционного происхождения современных популяций K16.

 

В число 16 «предполагаемых предковых» популяций в K16 входят следующие выделенные группы:

Австрало-веддоидная
Палеолитические охотники-собиратели Кавказа
Американские аборигены
Охотники-собиратели скандинавского мезолита
Австронезийцы
Ближневосточные неолитические земледельцы
Сибирские аборигены
Ближне-восточные популяции
Североафриканские популяции
Популяции западной Африки
Северные популяции Индостана
Юго-восточноазиатские популяции
Восточные охотники-собиратели
Неолитическое население Европы
Восточно-африканские популяции
Западноевропейские охотники-собиратели

 

Таблица FST между компонентами K11 (FST — Индекс фиксации Райта Fst, отражающий меру дифференциации популяций)

Кластеризация компонентов модели K11 по степени дифференциации

Таблица FST между компонентами K16

Кластеризация компонентов модели K16 по степени дифференциации

 

На следующем PCA графике отображены 2 группы компонентов — предковые компоненты K16 (полученные в программе ADMIXTURE в ходе анализа современных популяций) и предковые компоненты K11 (они вычислены в той же программе, но на другой выборке аутентичных палеогеномов). Поскольку у пользователей подобных калькуляторов часто возникает вопрос о соотношении компонентов разных моделей калькуляторов, я решил разместить их на одном графике. Методология довольно проста. Сначала я сгенерировал в программе PLINK 220 «синтетических» геномов (20 индивидов в 11 группах). В основу положен предложенный Понтикосом метод популяционных «zombies», в котором используется частоты аллелей снипов, полученных в программе ADMIXTURE. Каждая из 11 групп состоит из 20 «индивидов», геном которых на 100% состоит из одного компонента.
То же самое я сделал с компонентами K16. Затем в целях изучения соотношения компонентов этих двух разных моделей, я пропустил «геномы синтетических индивидов» K16 через калькулятор K11. В итоге выяснилось, что только несколько компонентов K16 полностью совпадают с компонентами K11 (например, Amerindian и African). Остальные компоненты K16 разложились на комбинации компонентов K11. Этот простой эксперимент еще раз подтвердил очевидный факт: предковые компоненты ADMIXTURE, выявленные в ходе анализа современных популяций только в редких случаях соответствуют настоящим предковым компонентам. Большинство подобных компонентов возникают в результате сложного процесса фиксации аллельных частот, например в тех случаях, когда непосредственно после смешивания предковых групп разного происхождения происходит процесс генетического дрейфа. Закон Харди—Вайнберга утверждает, что в теоретической идеальной популяции распределение генов будет оставаться постоянным из поколения в поколение. Так, в популяции растений количество «внуков» с генами высокорослости будет ровно таким же, сколько было родителей с этим геном. Но в реальных популяциях дело обстоит иначе. Из-за случайных событий частота распределения генов из поколения в поколение несколько варьирует — это явление называется дрейфом генов. Рассмотрим крупную размножающуюся популяцию со строго определенным распределением аллелей. Представим, что по той или иной причине часть этой популяции отделяется и начинает формировать собственное сообщество. Распределение генов в субпопуляции может быть нехарактерным для более широкой группы, но с этого момента и впредь в субпопуляции будет наблюдаться именно такое, нехарактерное для нее распределение. Это явление называется эффектом основателя.Дрейф генов сходного типа можно наблюдать и на примере явления с запоминающимся названием эффект бутылочного горлышка. Если по какой-либо причине численность популяции резко уменьшится — под воздействием сил, не связанных с естественным отбором (например, в случае необычной засухи или непродолжительного увеличения численности хищников), быстро появившихся и затем исчезнувших, — то результатом будет случайное устранение большого числа индивидуумов. Как и в случае эффекта основателя, к тому времени, когда популяция вновь будет переживать расцвет, в ней будут гены, характерные для случайно выживших индивидуумов, а вовсе не для исходной популяции.

Вот эта таблица с усредненными значениями «симулянтов» компонентов K16 в калькуляторе K11 (колонки — компоненты K16, столбцы — компоненты K11, их пересечения — проекция компонентов K16 в компоненты K11).

Для облегчения понимания сказанного, приведу немного теории. Начну с основ.

Определение базовых терминов

ADMIXTURE (буквально: примесь) – это компьютерная программа (анализ), позволяющая выявлять смешанность состава некоего набора индивидов на основе данных о генотипах и тем самым строить предположения о происхождении популяции.

Принцип работы ADMIXTURE.

Рассмотрим принцип работы ADMIXTURE на примере образцов и популяций из проекта HapMap.

Всего у нас N = 324 образца/индивида, каждый из которых относится к одной из четырех нижеперечисленных популяций:

АФРИКА (ASW) – Африканские предки из Юго-Западной части США
ЮТА (CEU) – жители штата Юта США с корнями из Северной и Западной Европы
МЕКСИКА (MEX) – Мексиканцы, Лонг-Айленд США
ЙОРУБА (URI) – Йоруба, Нигерия
Для удобства дальнейшего изложения будем называть эти популяции «известными».

Также мы предполагаем, что они произошли от К разных предковых популяций (мы не знаем от каких именно). В дальнейшем будем называть эти предковые популяцие «предполагаемыми предковыми». Этих «предполагаемых предковых» популяций на самом деле не существует, у них нет общепризнанных названий и характеристик. И на этом этапе мы даже не знаем какие образцы к какой из этих К популяций могут быть отнесены. Теоретически возможно, что образцы из одной и той же «известной» популяции могут принадлежать к двум разным «предполагаемым предковым» популяциям.

Пример 1.

Предположим, что К = 3.

ADMIXTURE далее работает с образцами (их генотипами) и заданным нами числом К = 3. Имея сведения о генотипах и предположение о количестве «предполагаемых предковых» популяций (К) ADMIXTURE строит свою модель (предположение) того, каков вклад каждой из «предполагаемых предковых» популяций в каждый индивид. В результате мы имеем для каждого индивида 3 цифры: количественный вклад каждой из трех популяций (или образно говоря, на сколько процентов данный индивид состоит из первой «предполагаемой предковой» популяции, на сколько – из второй и на сколько – из третьей). При этом может быть и такая ситуация, что у конкретного индивида в составе отсутствует какая-то из «предполагаемых предковых» популяций, даже возможно, что он принадлежит только к одной из «предполагаемых предковых» поуляций. Предположим, для индивида №1 эти цифры такие: 0.3, 0.5 и 0.2. Что эти цифры означают? Означают они доли каждой из «предполагаемых предковых» популяций (ППП) в индивиде №1, т.е. индивид состоит на 30% из первой ППП, на 50% — из второй и 20% — из третьей. Чем больше вклад каждой ППП в индивида, тем больше индивид является «носителем» данной популяции и ее представителем.
Так называемый этно-популяционный калькулятор ДНК представляет собой инструмент, позволяющий использовать заранее определенные (вычисленные) компоненты этнического происхождения K для определения той комбинация исходных предковых компонентов дает наилучшее соответствие (аппроксимирует) происхождение носителя тестируемой ДНК.

При создании калькулятора ДНК в основу берется определенная модель (например, задается исходное число компонентов или состав референсной выборки), что неизбежно приводит к определенным уступкам в плане точности и проявлению слабых сторон модели. Например, часто люди критикуют подобные модели калькуляторов за излишнюю европоцентричность и недостаточную представленность геномов из других мест, или же используемые для определения компонентов происхождения выборки данных по отдельным популяциям слишком малы для определения сложной субструктуры генофонда референсной популяции. Наконец, более грамотные люди указывают на отсутствие необходимо инструментария (например, формальной статистики) для проверки статистической значимости определенных компонентов в отдельных моделях калькулятора.
Движок обеих калькуляторов — все та же программа DIYDodecad, После того, как ппрограммма ДНКа калькулятора выдаст первичные результаты — процентное распределение компонентов этно-популяционного происхождения в изучаемом геноме, можно будет перейти к вторичному анализу. Суть его проста — зная процентную комбинацию компонентов происхождения в своем геноме, довольно просто смоделировать свой геном в виде смеси нескольких референсных популяций.

Поэтому, в отличие от предыдущих релизов, K11 и K16 будут включать в себя дополнительный контент:

1) классический Oracle, позволяющий смоделировать анализируемый «геном» (точнее, набор из 100-200 тысяч информативный снипов) в виде комбинации двух референсных популяций, а также установить группу генетически ближайших референсных популяций к геному изучаемого индивида. Однако этот инструмент не может быть использован в случае сложного смешанного происхождения (например, когда изучаемый индивид происходит из более чем двух разных этнических популяций). Иногда программа выдает довольно глупые комбинации, cущественным образом понижая достоверность результатов. Впрочем основное преимущество Oracle и состоит в том, что программа предлагает вместо окончательного «простого» решения список альтернативных вариантов.

Пример: в качестве примера я буду использовать собственные данные.
Исходя из полученных в модели K16 значений компонентов, мой условный наиболее близок к восточнославянским популяциям
«Ukrainian-Center» «2.5884»
«Pole» «3.0962»
«Sorb» «3.1733»
«Polish_West» «3.5992»
«Russian-North-West» «3.7265»
«Russian_Smolensk» «3.834»
«Polish» «4.0348»
«Belarusian_EastBelarus» «4.0852»
«Belarusian_WestBelarus» «4.1216»
«DonKuban_cossack» «4.7769»

В комбинированном варианте двух смешанных популяций распределение предковых компонентов происхождения может быть аппроксимировано следующими комбинациями:

«65.8% Belarusian_EastBelarus + 34.2% Norwegian» «1.1023»
«66.4% Belarusian_EastBelarus + 33.6% Icelandic» «1.1118»
«80.9% Latvian + 19.1% Spanish_Baleares_IBS» «1.1154»
«30% French + 70% Lithuanian» «1.1206»
«29% French + 71% Latvian» «1.1215»
«55% French_West + 45% Lithuanian_Zemajitia» «1.1302»
«28.9% French_East + 71.1% Latvian» «1.1402»
«29% French_Northwest + 71% Latvian» «1.1563»
«72.3% Belarusian_EastBelarus + 27.7% Orcadian» «1.1766»
«57.2% European_Utah + 42.8% Lithuanian_Zemajitia» «1.1825»

Основная часть генома — условно славяно-балтийская (что ожидаемо), но с существенным сдвигом в сторону Скандинавии и западной Европы(примерно 20-30%). Скорее всего, это наследие готов, или контактов балтийских племен с викингами. Интересно, что модель K11 (c использованием современных референсных популяций) дает примерно такой же расклад — разве что древний скандинавско-германский пласт выражен чуть резче чем в модели K16

«Belarusian_West» «2.3841»
«Belarusian» «2.4187»
«Pole_Poland» «2.5278»
«Belarusian_East» «3.7288»
«Russian_Central» «3.7635»
«Swede» «3.9724»
«Russian_cossack» «4.1139»
«Ukrainian» «4.2647»
«Russian_Southern» «4.5204»
«Ukrainian_East» «4.8635»
«66.6% Icelandic + 33.4% Latvian» «1.586»
«41.1% Latvian + 58.9% Orcadian» «1.5898»
«47.9% Lithuanian + 52.1% Orcadian» «1.6007»
«60.2% Icelandic + 39.8% Lithuanian» «1.6082»
«5.7% Basque_Spanish + 94.3% Belarusian» «1.6386»
«5.8% Basque_French + 94.2% Belarusian» «1.6406»
«67.2% Belarusian + 32.8% Swede» «1.659»
«40.2% Lithuanian + 59.8% Norwegian» «1.6876»
«33.7% Latvian + 66.3% Norwegian» «1.689»
«94.1% Belarusian + 5.9% Spanish_Pais_Vasco_IBS» «1.7359

В палеокалькуляторе K11 (т.е. с древними геномами) картинка кажется более убедительной

«Unetice_EBA» «2.7065»
«Bell_Beaker_Czech» «5.0633»
«British_AngloSaxon» «5.1998»
«Nordic_LN» «5.6157»
«Corded_Ware_Proto_Unetice_Poland» «6.3751»
«Nordic_MN_B» «6.3865»
«Halberstadt_LBA» «6.4422»
«BenzigerodeHeimburg_LN» «7.4695»
«Nordic_IA» «7.5404»
«Corded_Ware_Estonia» «7.7635»

Из всех палеогеномов наиболее близок к моему геном представителя унетицкой культуры. Происхождение унетицкой культуры до сих пор не выяснено. Между позднейшими энеолитическими культурами и унетицкой культурой существует типологический и хронологический разрыв. Наибольшее признание в результате последних исследований получило предположение, согласно которому в ее возникновении главную роль сыграли культура колоколовидных кубков и надиревская культура, распространенная в Венгрии (см. ниже). У культуры колоколовидных кубков и унетицкой имеется сходство в керамике, в погребальном обряде и в орудиях труда. Небольшую роль могла сыграть культура шнуровой керамики, хотя в целом они очень различаются. Закономерно, что следующими — хотя и с большим отрывом — близкими к моему геному группами палеогеномов являются геномы древних англосаксов (которые близки к древним скандинавам) и представителей чешского ареала культуры колоковидных кубков).
Аналогично, в режиме смешенных популяций хорошо заметны две тенденции. Во-первых, мой геном может быть представлен в виде комбинации палеогенома представителя позднебронзового века (Хальберштадт) и палеогеномов восточных охотников-собирателей эпохи энеолита, во-вторых как смесь 23.4% генома представителей балтийской позднебронзовой эпохи и все того же позднебронзового палеогенома из Хальберштадта

«86.4% Halberstadt_LBA + 13.6% Karelia_HG» «2.139»
«74.1% Bell_Beaker + 25.9% LesCloseaux13_Mesolithic» «2.1574» «35.9% Hungary_BA + 64.1% Poltavka_MBA_outlier» «2.319»
«65.7% Halberstadt_LBA + 34.3% Poltavka_MBA_outlier» «2.4387»
«83.2% Alberstedt_LN + 16.8% Karelia_HG» «2.443»
«23.4% Baltic_LBA + 76.6% Halberstadt_LBA» «2.4846»
«16.7% Europe_MN + 83.3% Poltavka_MBA_outlier» «2.4897»
«83.4% Halberstadt_LBA + 16.6% Samara_Eneolithic» «2.536»
«12.9% Halberstadt_LBA + 87.1% Unetice_EBA» «2.5603»
«16.1% Bell_Beaker_Czech + 83.9% Unetice_EBA» «2.5747»

2) файлы модели K11 и K16 для более сложной программы 4Admix (разработанной Александром Бурнашевом). Вторым инструментом вторичного анализа является 4Mix. Он работает по методу brute-force, шаг за шагом перебирая все возможные комбинации, а по окончанию цикла программа возвращает результат с наименьшим евклидовым расстоянием (по выбору можно использовать гауссово сглаживание, снижающее случайный статистический шум результатов). Как и в классическом Oracle, комбинация cмешиваемых этнических групп не может содержать более 4 популяций, хотя в отличие от классического Oracle, программа может моделировать комбинации из 3 и 4 этнических групп.

Пример. Приведу пример этих 3- и 4-членных аппроксимаций. В принципе, все то же самое, c той лишь разницей что теперь программа выделяет в комбинациях балтийскую и славянскую составляющую. Интересно, что скандинавская составляющая никуда не исчезла, оставаясь в пределах 20-25%
Using 3 populations approximation:
1 50% Belarusian_EastBelarus +25% English_Kent_GBR +25% Latvian @ 0.973956
2 50% Belarusian_EastBelarus +25% English_Kent_GBR +25% Lithuanian @ 0.988467
3 50% Latvian +25% French +25% Balt @ 1.036492
4 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Connacht @ 1.05259
5 50% Lithuanian +25% Sorb +25% French_West @ 1.059638
6 50% Belarusian +25% Icelandic +25% French_West @ 1.06158
7 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Cork_Kerry @ 1.074796
8 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_East +25% Irish_Connacht @ 1.076771
9 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Irish_Ireland @ 1.078576
10 50% Belarusian +25% Norwegian +25% French_West @ 1.079741
11 50% European_Utah +25% Lithuanian_Zemajitia +25% Balt @ 1.084317
12 50% Dane +25% Belarusian_EastBelarus +25% Lithuanian_Aukstajtia @ 1.090086
13 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Scottish_Highlands @ 1.093951
14 50% Lithuanian +25% North_European +25% Sorb @ 1.103744
15 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% English_GBR +25% French_Northwest @ 1.105369
16 50% Lithuanian_Zemajitia +25% French +25% Scottish_Grampian @ 1.106616
17 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_Northwest +25% Irish_Connacht @ 1.106771
18 50% Lithuanian_Aukstajtia +25% French_Northwest +25% Scottish_Dumfries_Galloway @ 1.108261
19 50% Lithuanian +25% French_West +25% Polish_West @ 1.113695
20 50% Latvian +25% North_European +25% Sorb @ 1.115164
31501779 iterations.
Using 4 populations approximation:
1Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Zemajitia+Swede+French_West @ 0.947002
2Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Sorb @ 0.971605
3Belarusian_EastBelarus+Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Latvian @ 0.973956
4Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Polish_East @ 0.986863
5Belarusian_EastBelarus+Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian @ 0.988467
6 French+Lithuanian_Zemajitia+Swede+Balt @ 0.98916
7Belarusian_EastBelarus+English_Kent_GBR+Lithuanian_Aukstajtia+Polish @ 0.996302
8 Belarusian+Lithuanian_Aukstajtia+Shetlandic+French_West @ 1.010485
9 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+Irish_Ulster+French_West @ 1.01227
10 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Ulster @ 1.012977
11 Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Aukstajtia+Swede+Welsh @ 1.013043
12Belarusian_EastBelarus+European_Utah+Lithuanian_Aukstajtia+Swede @ 1.013805
13Belarusian_EastBelarus+Lithuanian_Aukstajtia+Swede+French_West @ 1.018296
14German_NorthGermany+Lithuanian_Aukstajtia+Balt+French_West @ 1.026503
15 Lithuanian_Aukstajtia+Sorb+Ukrainian-Center+French_West @ 1.027473
16 Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Connacht @ 1.031967
17Belarusian+Lithuanian_Zemajitia+French_West+Irish_Cork_Kerry @ 1.035716
18 French+Latvian+Latvian+Balt @ 1.036492
и т.д.
То же самое, но в модели K11
Using 3 populations approximation:
1 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Halberstadt_LBA +25% Hungary_BA @ 2.031302
2 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Bell_Beaker_Czech +25% Hungary_BA @ 2.072453
3 50% British_AngloSaxon +25% Halberstadt_LBA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.125791
4 50% Bell_Beaker +25% Bell_Beaker +25% LesCloseaux13_Mesolithic @ 2.209118
5 50% Halberstadt_LBA +25% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.244371
6 50% Halberstadt_LBA +25% Hungary_BA +25% Samara_HG @ 2.270667
7 50% Halberstadt_LBA +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Unetice_EBA @ 2.291406
8 50% Poltavka_MBA_outlier +25% British_AngloSaxon +25% Hungary_BA @ 2.30791
9 50% Bell_Beaker_Czech +25% Hungary_BA +25% Samara_HG @ 2.356281
10 50% Halberstadt_LBA +25% Nordic_BA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.358744
11 50% Bell_Beaker +25% Hungary_BA +25% Karelia_HG @ 2.369978
12 50% Bell_Beaker_Czech +25% Nordic_BA +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.385823
13 50% Halberstadt_LBA +25% Corded_Ware_Germany +25% Nordic_BA @ 2.490915
14 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Hungary_BA +25% Unetice_EBA @ 2.503754
15 50% British_AngloSaxon +25% Bell_Beaker_Czech +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.53217
16 50% Halberstadt_LBA +25% Baltic_LBA +25% Halberstadt_LBA @ 2.540751
17 50% Hungary_BA +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Samara_HG @ 2.551414
18 50% Poltavka_MBA_outlier +25% Alberstedt_LN +25% Hungary_BA @ 2.561557
19 50% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier +25% Unetice_EBA @ 2.575398
20 50% Bell_Beaker_Czech +25% British_AngloSaxon +25% Poltavka_MBA_outlier @ 2.575919
1127348 iterations.
Using 4 populations approximation:
1 Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Poltavka_MBA_outlier+Poltavka_MBA_outlier @ 2.031302
2 Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier+Unetice_EBA @ 2.03713
3 Bell_Beaker_Czech+Hungary_BA+Poltavka_MBA_outlier+Poltavka_MBA_outlier @ 2.072453
4 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier+Unetice_EBA @ 2.088049
5 British_AngloSaxon+British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.125791
6 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.131526
7 Bell_Beaker_Czech+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.14648
8 Bell_Beaker+Bell_Beaker+Bell_Beaker+LesCloseaux13_Mesolithic @ 2.209118
9 Bell_Beaker_Czech+Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.209365
10 Bell_Beaker_Germany+British_AngloSaxon+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.212982
11 Bell_Beaker_Czech+Bell_Beaker_Germany+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.232922
12 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.244371
13 British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Nordic_BA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.254756
14 Alberstedt_LN+British_AngloSaxon+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.255589
15 Bell_Beaker_Czech+British_AngloSaxon+Halberstadt_LBA+Poltavka_MBA_outlier @ 2.256027
16 Halberstadt_LBA+Halberstadt_LBA+Hungary_BA+Samara_HG @ 2.270667

3) новым инструментом в релизе будет R программа nMonte, разработанная голландцем Гером Гизбертом. В отличие от двух предыдущих инструментов (ограниченных в числе используемых для моделирования этнических групп), nMonte позволяет использовать для моделирования (аппроксимации) генмоа все референсные грппы. Программа использует алгоритм эволюционного моделирования по методу Монте-Карло.
После пошагового добавления новой популяции программа определяет уменьшается ли евклидово расстояние; если да, то шаг сохраняется, в противном случае шаг отклоняется. Алгоритм завершает свою работу после выполнения примерно миллиона шагов. Как и два предыдущих инструмента программа стремится к минимализации евклидова расстония; но похоже за счет использования метода Монте-Карло, алгоритм гораздо более эффективен. И, также, как и в других инструментах, в nMonte «наилучшая комбинация» определяется как комбинация с наименьшим расстоянием. Недостаток же nMonte состоит в том, что она выдает только наилучшее подходящее решение, в то время как Oracle представляет альтернативные варианты.
Пример. Посмотрим, сколько потенциальных предковых популяций выдаст nMonte при аппроксимации моего генома.
При первом запуске программа выдала комбинацию (в cкобках процентный вклад референсной популяции) следующих 65 популяций. Также как и в других инструментах, тон задают балтийские популяции, а также белорусы, сорбы и поляки.

Lithuanian_Zemajitia 10.1
Latvian 7.85
Lithuanian_Aukstajtia 7.85
Belarusian_SouthBelarus 6.55
Lithuanian 6.5
Pole 5.45
Belarusian_WestBelarus 4.8
Balt 4.35
Sorb 3.35
Belarusian 3.05
Belgian 3
Norwegian 2.95
Czech 2.75
Dane 2.5
Slovak 2.4
Icelandic 1.9
Swede 1.9
French_SouthFrance 1.5
Slovenian 1.5
Basque_Spanish 1.3
Frisian 1.15
German_NorthGermany 1.1
Sardinian 1.1
Polish_East 1.05
Ukrainian_WestUkraina 1
Polish 0.95
Basque_French 0.9
Orcadian 0.7
Spanish_Pais_Vasco_IBS 0.7
Hungarian 0.65
Irish_Connacht 0.65
DonKuban_cossack 0.6
Dutch 0.6
Ukrainian_EastUkraina 0.6
Scottish_Argyll_Bute_GBR 0.55
European_Utah 0.5
English_GBR 0.45
Croatian 0.4
Russian-Pskov 0.4
French_South 0.4
Welsh 0.35
Irish_Ulster 0.35
Scottish_Fife 0.3
German_SouthGermany 0.25
Scottish_Dumfries_Galloway 0.25
Belarusian_CentralBelarus 0.2
Datog 0.2
English_Cornwall_GBR 0.2
North_European 0.2
Ukrainian 0.2
Russian_Orjol 0.15
Afar 0.1
Belarusian_EastBelarus 0.1
English_Kent_GBR 0.1
Irish 0.1
Kambera 0.1
Russian_Smolensk 0.1
Vindija 0.1
Belarusian-East 0.1
Spanish_Canarias_IBS 0.1
Spanish_Cantabria_IBS 0.1
Spanish_Cataluna_IBS 0.1
Peruvian 0.05
Russian_Voronezh 0.05

В K11 показаны следующие палеогеномы (или их группы). По-прежнему, основа генома 40% моделируется как геном представителя культуры колоколовидных кубков.

«Bell_Beaker» 40.3
«Halberstadt_LBA» 31.6
«Samara_HG» 8.5
«Tyrolean_Iceman_EN» 2.05
«Esperstedt_MN» 1.95
«Swedish_Mesolithic» 1.95
«BerryAuBac_Mesolithic» 1.85
«Swedish_Motala_Mesolithic» 1.7
«Bichon_Azillian» 1.6
«Continenza_Paleolithic» 1.5
«Hungary_BA» 1.5
«LaBrana_Mesolithic» 1.35
«Bell_Beaker_Germany» 1.05
«Hungary_HG» 0.85

4) следующим новым инструментом будет 4mix, более упрощенный вариант 4Admix. Он разработан тем же Г. Гизбертом. Основное отличие от 4Admix — если 4Admix перебирает все возможные комбинации из 4 популяций, то в 4mix можно эксплицитно задавать отдельные комбинации и определять евклидову дистанции между этой комбинацией и аппроксимируемым геномом в пространстве моделей
5) карты компонентов с аннотацией. Аннотации компонентов будут чуть позже, а вот карты уже готовы

Карты распространения некоторых компонентов K16 и K11  в ряде географических ареалов

6) я включил в релиз модифицированный скрип GPS лаборатории Элхайка для определения географического ареала происхождения предков человека, чей геном является предметом изучения. Я включил пару строчек кода для проецирования вычисленных географических координат на географическую карту.
Пример. Ниже показаны две карты, на которые спроецированы географические координаты вычисленной алгоритмом GPS (GPS DNA tool ) точки «этнического происхождения».
Я проверил работоспособность алгоритма на обеих моделях.
В модели K16 (современные популяции) GPS-координаты точки моего «происхождения» 49.7648663288835 32.4345922625112 (примерно 49 градусов северной широты и 32 градуса восточной долготы), т.е где-то на левом берегу Днепра в Украине. Как утверждают разработчики программы, она позволяет определить место происхождения с радиусом погрешности в 500 км. Я вычислил расстояние от полученной точки до настоящего места жительства предков (южная часть Брестской области) и получилось 470 км. Т.е точка попадает в радиус, хотя и с некоторым трудом.

Что касается модели K11 (древние геномы), то в этой модели мой «Urheimat» локализуется — весьма ожидаемо — на землях древней унетицкой и лужицких культур (51.1254133094371 13.2336209988448)

 

 

Вторая фаза нового проекта: африканская когорта

В одной из предыдущих записей я упомянул о том, что из 3 начальных когорт образцов «геномов» я провел импутацию азиатской и европейской когорты,  осталась получить результаты по последней — третьей когорты — африканской.

По состоянию на текущий момент,  закончена работа на 18 из 22 хросомом в выборке африканских популяции. Согласно моему прогнозу,  процесс импутации недостающих генотипов по 4 оставшимся хромосомам будет завершен в  самое ближайшее время.

А пока — т.н. «этноплот» или промежуточные результаты анализа главных компонент в пространстве генетического разнообразия африканских этнических групп.

Еще раз о палеогеномах европейцев (к работе Haak et. al. 2015)

Еще когда появились первые анонсы препринта статьи Haak et al. 2015,  можно было сделать интуитивные предположения о том, что использованные в работе образцы палеогеномов будут всесторонне изучены не только авторами статьи, но и многочисленными любителями, причем ожидаемая степень детализации полученной картины генетического разнообразия  будет предположительно выше именно у последних (т.е всевозможных геномнных блоггеров).

Так оно и вышло. Давид Веселовский из Eurogenes провел целый ряд экспериментов с объединенным базовым набром «геномов» современных популяций и так называемых древних геномов.  В частности, в одном из своих анализов он задействовал новую программу qpAdm из последней версии пакета Admixtools,  и в ходе пробного моделирования геномов представителей ямной культуры из самарской культуры был наилучшая аппроксимация (fit, подгонка) была получена в комбинации  51.4% генома  охотников-собирателей Самары и  48.6 современных грузин (STD 0,032, chisq 3,890, р-value 2.20661e-22). Образцы палеогеномов представителей  шнуровой керамики могут быть в свою очередь смоделированы как 73% геномов ямников + 27% палеогеномов Esperstedt_MN (STD 0,060, chisq 2,621, р-value 9.74968e-06).

Это интересный результат, главным образом потому данные лингвистики позволяют предположить, что ранние индоевропейцы — по-видимому, кочевники ямной культуры или их предки — были в тесном контакте с прото-картвельскими популяциями.  Похожий результат был получен авторами статьи (у которых представители ямной культуры выступали как 50% -50% смесь геномов карельских охотников-собирателей и армян), а также в моих экспериментах, в которых геномы современных белорусов были представлены  гибридной моделью  современных геномов армян и палегеномов шведских охотников-собирателей Motala.

Впрочем, я согласен с Веселовским — главная проблема с подобными ретроспективными анализами заключается в том, что про причине отсутствия большого количества достоверных древних палеогеномов, популяционные генетики часто вынуждены моделировать древние популяции посредством комбинаций современных популяций. Как отмечает Веселовский, в генофонде современных грузин присутствует (по его оценке) 20% так называемого ANE-компонента, который, вероятно, прибыл на Кавказ из Евразийской степи. Если это так, то алгоритм qpAdm  может переоценить «кавказский» компонент в геномах ямников, по крайней мере, на 10%.

В другом своем анализе Веселовский уделил особое внимание  проблеме происхождения одного из основных компонентов в геноме древних ямников. Так например, анализ Admixture в Haak et al. 2015 включает в себя ряд интригующих компонентов с К = 16 до К = 20, которые, как правило составляют более 40% от генетической структуры потенциально прото-индо-европейских геномов ямников. Веселовский выделил компонент сигнализирующий этот тип «адмикса» и подробно изучил его. Заслуживает внимание тот факт, что компонент достигает своего пика на Кавказе и в горах Гиндукуша, и в целом показывает сильную корреляцию с регионами относительно высокой частоты связанных с палеогеномом MA1  компонентами происхождения (ANE). С другой стороны, другой компонент ямников достигает пиковых значений у  ранних европейских фермеров (EEF), у которых отсутствует компоент ANE.

Выделенные Веселовским 3 основные компоненты-составляющие геномов ямников были преобразованы в синтетические популяции (центрально-азиатская, европейская и неолитическая европейская), которые в свою очередь использовались в качестве подмножества для вычисления векторов загрузки (loadings) в PCA анализе полного набора современных популяций.

https://drive.google.com/file/d/0B9o3EYTdM8lQak82NFVYSUJfWGc/preview

Очевидно, более детальный расклад и анализ вклада различных компонентов геномов палеоевропейцев в геном современных жителей Европы можно найти в подробном анализе Сергея Козлова  «Палеоевропейцы из работы Haak et al, 2015 в свете анализа на IBD-сегменты«.

Как я уже упоминал ранее, мой опыт с «выведением» предкового аутосомного компонента индоевропейцев (обозначенного в статье Lazaridis et al. 2013 сокращением ANE) полностью удался. Поскольку всем очевидно, что этот компонент родственен «североиндийскому предковому компоненту» (ANI — обозначение из статьи Reich et al. 2009 и Moorjani et al 2011) о структуре генофонда индийских этнических групп), я взял 10 индийских этнических групп, имеющихся в кураторском наборе лаборатории Райха и проанализировал эту выборку в Admixture на пропорции вхождения их геномов в 2 априорно заданные кластеры. Первый кластер ANE был априорно задан 40 синтетическим индивидами, сгенерированными в программе Plink на основании расчитанных ранее частот аллелей «чистого» компонента ANE. В качестве дополнительного контрольного образца я использовал геном Malta1, т.к. он содержит в себе наивысшее содержание компонента ANE. Второй кластер был задан 4 индивидами Onge (одна из аборигенных народностей Андаманских островов). Как неоднократно указывалось в литературе, именно жители Андаманских островов являются самыми «чистыми» носителями т.н «южно-индийского» предкового компонента ASI (на континенте чистых носителей этого «компонента» не осталось, в том числе и среди популяций дравидов, ведда и мунда). После нескольких экспериментов по эвристическому методу проб и ошибок, я получил более или менее приемлимое разделение индивидов на 2 кластера, а затем вычислил частоты аллелей в каждом из этих кластеров. Любопытно, что в ходе опыта, удалось не только выделить компонент ANI, но и добиться неплохого уровня дискримнации между компонентом ANI, ANE, и благодаря этому, оба компонента могут быть включены в мой следующий этно-популяционный калькулятор.

Надежность компонентов я проверил на собственных данных. В рабочей модели калькулятора K14 удельное распределение этно-генографических компонентов моего генома выглядит следующим образом:

68.75% — европейский мезолитический компонент
13.12% — северо-евразийский компонент ANE
10.23% — европейский неолитический компонент
4% — ANI (северо-индийский предковый компонент)
1.6% — кавказский компонент
1.2% — алтайский компонент
0.2% — сибирский компонент

Затем я использовал 120 древних образцов аутосомной ДНК человека (начиная с верхнего палеолита до бронзового и железного веков) из последней работы и проработал их в бета-версии своего этно-популяционного калькулятора K14. Я надеялся выделить компонент ANE из ANI, но из таблицы видно, что это фактически один и тот же компонент

Когда я закончу полномерную импутацию всего набора данных от лаборатории Райха, я займусь проведением аналогичных экспериментов. А пока — примерно месяц назад я сообщил о начале первого этапа своего нового проекта. Согласно первоначальному замыслу, на первый этап — фазирование и импутация данных выборок из статей Haak et al .2015 (preprint) и Lazaridis et al. 2014 — я отводил месяц. Так оно и получилось.

В качестве затравки для импутирования я использовал набор 424329 снипов на 22 аутосомных хромосамх. Набор состоял из снипов, прошедших стандратный геномный контроль качества. Фазирование и импутация снипов я проводил с помощью пайплайна Molgenis.

По окончанию этого вычислительно-емкого процесса, мною был получен набор из примерно 5 миллионов снипов; после отсева не входящих в панели Illumina снипов у меня осталось 913841 снипов.

Ниже приведена похромосомная статистика снипов до и после импутации данных.
Как видно, на всех хромосомах (за исключением 19 и 20) количество снипов увеличилось примерно в два раза.

Для оценки качества импутации я сравнил импутированные генотипы своих данных с известными данными из своих сырых данных (снипы с иллюминовского чипсета 23andme) на предмет конкорданса (соответствия).
Оказалось, что у 6.5% импутированных генотипов оба варианта не совпадали с генотипам в rawdata от 23andme, у 17.33% — не совпадал один из двух вариантов. Таким образом, качество импутации составляет примерно 76.18%, что неплохо, учитывая что среднее значение качества импутации в программе IMPUTE v2 + SHAPEIT составляет примерно 69%.

Chromosome Pre-imputation Post-imputation Percentage of imputed snps

1 36638 88155 41.56
2 40140 90003 44.60
3 33218 62030 53.55
4 23594 54462 43.32
5 19731 55284 35.69
6 27979 56485 49.53
7 22804 49172 46.38
8 23072 48756 47.32
9 19369 42438 45.64
10 25340 49666 51.02
11 23145 46434 49.84
12 16967 45668 37.15
13 14998 35626 42.10
14 15529 36429 42.63
15 14663 27844 52.66
16 15034 33806 44.47
17 7799 24949 31.26
18 11697 27709 42.21
19 7102 17715 40.09
20 12654 5054 -39.94
21 6495 2572 -39.60
22 6361 13584 46.83
424329 913841 36.74

Для проверки полезности полученного набора (объединенного набора «реальных» и импутированных снипов), я соединил его с 112 образцами человеческих палеогеномов из новой статьи Haak et al. 2015. Полученный таким образом набор я проанализировал методом выделения главных компонент, первые две из которых я впоследствии использовал для построения графика главных компонент. Как мне кажется, получилось красиво и правдоподобно.

 

Через неделю работы в GoogleCloud, получил результаты второго цикла обработки (импутации и фазировки) палеогеномов. Напомню, задачей ставилось увеличение числа снипов палеогеномов до уровня, позволяющего проводить исследования с привлечением сторонних данных по современным человеческим популяциям (т.е не только по тем популяциям, которые включены в кураторский набор лаборатории Рейха, но и другим наборам, генотипированным на платформе Illumina; и что самое главное — с привлечением данных конкретных пользователей 23andme и FTDNA).

И если результатами первой части я был вполне доволен, то этого нельзя сказать о второй части. Теперь я понимаю, что ошибка содержалась в самом дизайне цикла второй части, в которой для импутации и фазирования использовались только реальные и «симуляционные» палеогеномы. В результате, хотя импутация и улучшила взаимное позиционирование палеогеномов в пространстве главных компонент генетического разнообразия, однако при слиянии импутированного в автономном режиме набора палеогеномов с набор полученным в первой части проекта, получилась картина. в которой палеогеномы образуют как бы параллельную субструктуру по отношению к современным популяциям.
Данное обстоятельство объясняется тем, что у древних геномов людей больше общего разнообразия между собой, чем с геномами современных людей (у которых в результате многочисленных генетических дрейфов и бутылочных горлышек большая часть разнообразия была потеряна). По этому причине, при независимой импутации древних геномов их сходство между собой только усилилось, а дистанция с современными популяциями увеличилась. Примечательно при этом, что пропорции вилкообразного разделения генетического разнообразия такие же, как и у современных людей.

На графике PCA эта ситуация прослеживается особенно хорошо, где отчетиливо видно наложение этих двух V-вилок друг на друга (см. нижний график)

Это означает одно — работу над проектом надо продолжить

2014 год — год палеогенетики и эпигенетики

Оглядываясь назад на события и открытия, коими в уходящем 2014 году ознаменовалась область исследований генетики человека, можно смело сказать что уходящий год был годом прорыва в двух принципиально различных направлениях — в палеогенетике, изучающей геномы популяций древних людей прошлого, и  в эпигенетике,  с помощью которой можно прогнозировать будущее (здоровье и качество жизни) отдельных людей.

---

Палеогенетика

В самом начале 2014 года, на руках немногочисленных исследователей  палеогеномов было менее десятка древних геномов человека, опубликованных в предыдущие года. К концу 2014 года опубликован ряд работ, посвященных попыткам генотипирования останков древних людей — от живших несколько тысячелетий назад до «усть-ишимца» с предположительным возрастом около 45 тысяч лет, неандертальцев и «денисовки». Количество таких расшифровок растет все быстрее, что не может не вызывать оптимизма.  Вторая половина 2014 года особенно примечательна как количеством подобных публикаций, так и числом полных геномных NGS-сиквенсов древних людей, размещенных в публичных репозиториях (банках геномных данных). Так, в сентябре в Nature была опубликована окончательная версия работы Lazaridis et al. 2014  «Ancient human genomes suggest three ancestral populations for present-day Europeans». Работа получила широкое освещение в СМИ, поскольку аналитическая выборка сэмплов в этом исследовании включала значительное количествао заново генотипированных (на чипе Affymetrix HumanOrigin) образцов ДНК из древних палеолитических стоянок Сибири (Афонтова Гора, Малта), представителя древней индейской культуры Кловис и палеоэскимоса Cаккак. В работе был представлен  целый  ряд образцов древней ДНК представителей европейских мезолитических и неолитических культур, опубликованных в более ранних работах 2012-2014 годов: Skoglund et a. 2014 «Genomic Diversity and Admixture Differs for Stone-Age Scandinavian Foragers and Farmers»(шведские земледельцы и охотники собиратели эпохи неолита); Olalde et al. 2014 «Derived immune and ancestral pigmentation alleles in a 7,000-year-old Mesolithic European» (дДНК мезолитического населения Иберийского полуострова) и т.д.

Опубликованные геномы так и остались бы достоянием небольшой группы ученых, и по-прежнему бы использовались бы только для сравнения с абстрактными и анонимизрованных данными референсных популяций человека, если бы усилиями пары любителей (прежде всего усилиям Чандракумара) палеогеномы не были преобразованы в привычные и удобные для популяционного анализа форматы  BAM, VCF и Plink binary, а также в стандартный формат геномных данных от FTDNA. По своей сути, преобразование состояло в сложной процедуре сборки генома из библиотек коротких геномных ридов (в формате sra., в котором эти риды хранятся в репозиториях крупных баз геномных данных). Полученные сборки геномов в формате sam/bam cравниваются с референсным геномом человека, и отличающиеся одиночные нуклеотидные полиморфизмы сохраняются в VCF файл. Здесь нужно помнить о том, что в этой процедуре не учитывался параметр качества сиквенса PHRED score. Традиционно рекомендуется использовать только те базовые пары, PHRED score которых превышает 30, т.е чья точность определения составляет 99.9% (или 1 ошибка на 1000 базовых пар). Кроме того, в этой процедуре разработчик не учел влияние постмортальных изменений ДНК. Cледует помнить, что ДНК, как и любая биомолекула, способна вступать в химические реакции с окружающим миром, тут-то и появляются различные модификации нуклеотидов (особенно по краям фрагментов древней ДНК). Наиболее частая постмортальная мутация — дезаминирование цитозинов (C), приводящая к возникновению урацилов (U) в последовательности древней ДНК, которые при проведении ПЦР многократно копируются «бездушным» ферментом ДНК-полимеразой как тимин (Т). Именно по этой причине, при оценке достоверности снипов в полученных из палеогеномов вариантах особое внимание требуется уделять транзициям C->T и  G->A.  Если при подсчете вариантов окажется, что такие транзиции встречаются чаще ожидаемого, то можно сделать вывод о существенном повреждении палео-ДНК.  И хотя по причине игнорирования этих ограничений, автором было получено большое количество снипов, в некоторых случаях, например при объединении полученных данных NGS c данными генотипирования с помощью классических технологий миркочипов, использование таких данных может существенно уменьшить качество интерпретации.

Тем не менее, благодаря этим усилиям, и не в меньшей степени, благодаря соотрудничеству с порталом Gedmatch и компанией  FTDNA, большинство клиентов ведущих компаний на рынке персональной геномики и генетической генеалогии (таких как 23andme, и FTDNA) могут сравнить свои данные с данными древних геномов либо путем сравнения частото аллелей, либо посегментно сравнивая свои хромосомы с гомологичными хромосомами древних геномов.  Более того, Феликс Чандракумар пошел дальше и разместил 10 наиболее качественных палеогеномов (т.е палеогеномов с наибольшим числом перекрывающихся разными микроматрицами снипов) на FTDNA. Таким образом, с помощью сервиса MyOrigins FTDNA, исследователи могут установить распределение «этно-популяционных составляющих» или «предковых этнопопуляционных компонентов» в этих древних геномов. Нужно помнить, конечно же, что в случае с наиболее древними геномами (геномами неандертальца, усть-ишимца и т.д.) полученное распределение более молодых компонентов (полученных из современных популяций) нельзя интерпретировать буквально.

Эту замечательную функцию дополняют калькуляторы Eurogenes, благодаря которым любой интересующийся человек может посмотреть, какой процент его/ее генома приходится на тот или иной древний геном. Для людей, озабоченных вопросами анонимности, Феликс разработал отдельное десктопное приложение  — калькулятор древней ДНК. Этот калькулятор  показывает, какой процент ДНК (составных сегментов) аутосомной ДНК клиента попадает в каждый из 30 образцов древней ДНК . Другими словами, он показывает  процент общих предков в сравнении современного ДНК и палеоДНК.

Подводя итоги года, можно сказать, что в области изучения древней ДНК все ожидания были оправданы.

---

Эпигенетика

Под эпигенетикой обычно понимают область знаний о совокупности свойств организма, которые не закодированы непосредственно в геноме, но могут и должны передаваться по наследству.Эпигенетика может быть определена как изучение механизмов контроля активности генов во времени и пространстве в процессе развития сложных организмов. К настоящему времени обнаружены и описаны различные механизмы контроля активности генов, однако в уходящем 2014 году особое внимание ученые уделяли  изучению одного из таких механизмов  — ферментативному (энзиматическому) метилированию самой генетической матрицы, то есть ДНК.

Метилирование — это изменение молекулы ДНК путем присоединения метильной группы (-СH3) к нуклеотиду C, причем необходимо, чтобы за С следовал нуклеотид G. Последовательность нуклеотидов -CG- называется СpG динуклеотидом, или CpG сайтом. Метилирование происходит не во всех клетках одновременно, поэтому говорят о проценте метилирования определенного CpG сайта.метилирование ДНК ощутимо сказывается на её взаимодействии (связывании) с различными белками. Во многих случаях метилирование по цитозиновым остаткам препятствует связыванию специфично реагирующих с ДНК ядерных белков (факторов), которые, собственно, и осуществляют разные генетические процессы, в том числе транскрипцию, репликацию и репарацию.Как известно, метилирование играет важнейшую роль в механизме экспрессии (т.е качественном и количественном проявлени) генотипа в фенотип. оказано, что с изменением профиля метилирования связаны такие заболевания, как различные виды рака, диабет первого и второго рода, шизофрения и т.д. Поэтому важно уметь анализировать профиль метилирования генома, и здесь перед энзимологией расскрываются огромные перспективы. Например, в 2014 году компания «СибЭнзайм» открыла новый фермент, на базе которого разработали новый метод детекции. Он позволяет определять, включен или выключен интересующий вас ген — э то управляющий механизм в организме, именно отключение отдельных генов ученые связывают с развитием рака:

С технической точки зрения, изучение метиляции ДНК происходит с использованием модифицированного варианта ChiPSeq (это комбинированный вариант иммунопреципитации хроматина (ChIP) и высокоэффективного секвенирования ДНК для определения участков связывания ДНК и белков). Не вдаваясь в биолого-химические подробности этого модифицированного метода, его можно кратко описать следующим образом. Каждый CpG сайт измеряется с помощью двух флуоресцентных проб. Флуоресцентный сигнал проб пропорционален соответственно количеству метилированных и неметилированных CpG сайтов в тестируемом образце.  Полученные данные образуют собой профиль метилирования, который удобно сравнивать с различными референсными образцами. Как уже говорилось выше, этот профиль можно использовать не только для медицинских целей (например, для изучения эпигенетических факторов развития различных заболеваний), но и для более общих целей. В недавном исследовании, проведённом специалистами из Калифорнийского университета (UCLA), выявило биологические часы, встроенные в геном человека и оно впервые определило, что внутренние часы в состоянии точно оценить возраст различных человеческих органов, тканей и клеток. Исследователи обратили свое внимание на метилировании – естественном процессе, изменяющем химический состав ДНК. Он изучил 121 набор данных, собранных ранее исследователями, изучавшими метилирование здоровых и раковых тканей человека. Проанализировав информацию по 8000 образцов из 51 типа тканей и клеток со всего тела, исследователи смогли определить, как возраст влияет на уровни метилирования с рождения до 101 года. Он определил, что метилирование работает на 353 участках ДНК, которые изменяются с возрастом. Таким образом, профиль метилирования ДНК представляет собой наиболее надежную метрику для расчетов биологического возраста как отдельных органов, так и всего организма.

Принимая это во внимание, можно сказать что и в последующие года эпигенетику ожидают радужные перспективы.

Публикации и работа с палеогеномами

Как я уже отмечал в своих предыдущих записях, за последние годы был опубликован ряд работ, посвященных попыткам генотипирования останков древних людей — от живших несколько тысячелетий назад до «усть-ишимца» с предположительным возрастом около 45 тысяч лет, неандертальцев и «денисовки». Количество таких расшифровок растет все быстрее, что не может не вызывать оптимизма.  Вторая половина 2014 года особенно примечательна как количеством подобных публикаций, так и числом полных геномных NGS-сиквенсов древних людей, размещенных в публичных репозиториях (банках геномных данных). Так, в сентябре в Nature была опубликована окончательная версия работы Lazaridis et al. 2014  «Ancient human genomes suggest three ancestral populations for present-day Europeans». Работа получила широкое освещение в СМИ, поскольку аналитическая выборка сэмплов в этом исследовании включала значительное количествао заново генотипированных (на чипе Affymetrix HumanOrigin) образцов ДНК из древних палеолитических стоянок Сибири (Афонтова Гора, Малта), представителя древней индейской культуры Кловис и палеоэскимоса Cаккак. В работе был представлен  целый  ряд образцов древней ДНК представителей европейских мезолитических и неолитических культур, опубликованных в более ранних работах 2012-2014 годов: Skoglund et a. 2014 «Genomic Diversity and Admixture Differs for Stone-Age Scandinavian Foragers and Farmers»(шведские земледельцы и охотники собиратели эпохи неолита); Olalde et al. 2014 «Derived immune and ancestral pigmentation alleles in a 7,000-year-old Mesolithic European» (дДНК мезолитического населения Иберийского полуострова) и т.д.

В этой связи необходимо также отметить статью Carpenter et al. 2013 «Pulling out the 1%: whole-genome capture for the targeted enrichment of ancient DNA sequencing libraries», в которой целый авторский коллектив представил результаты исследований древних образцов ДНК найденных в захоронениях бронзового века II тыс. д.н.э (Болгария и Дания).  В следующей работе опубликованной в конце октября, Gamba et al. 2014. «Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory»,  читателям была представлена хронологическая перспектива на процесс изменения генофонда населения популяций живших на территории  Паннонской равнины на протяжении 5000 лет (с эпохи неолита до конца железного века), проиллюстрированная на примере изучения 13 образцов древней ДНК. Параллельно вместе с этим Wellcome Trust Sanger Institute разместил геномные «риды» геномов древних англосаксов и бриттов (сама статья еще находится в процессе пре-публикации, презентация статьи была представлена на последней конференции AJHG).

Более важные публикации появилась совсем недавно. В частности, таковой публикацией является статья Fu et al. 2014 «Genome sequence of a 45,000-year-old modern human from western Siberia» о  геноме так называемого «усть-ишимца» (возраст останков которого датируются 45 000 д.н.э) и статья Seguin-Orlando et al. 2014 «Genomic structure in Europeans dating back at least 36,200 years», посвященная обсуждению результатов анализа ДНК знаменитого «папусоида»  с палеолитической стоянки Костенки-14.Тело мужчины, жившего 37 тыс. лет назад и найденное в 1954 г. на юго-западе России, оказалось источником старейшей европейской ДНК. Анализ его генома, опубликованный на прошлой неделе, показывает, что большинство разнообразных европейских генетических комбинаций существуют более 30 тыс.лет и пережили последний ледниковый период. Генетики обнаружили что ДНК Костенки-14 является близкородственным по отношению к раннеевропейским охотникам-собирателям, современным европейцам и жителям Сибири.
В то же время другой древний геном, данные о котором были опубликованы несколько недель назад, принадлежащий сорокапятитысячелетнему западному сибиряку, известному как Усть-Ишим, имел родство как с европейцами, так и с азиатами.  Любопытно, что в этой статье подтверждается то о чем я говорил гораздо раньше: процент неандертальских генов у древних евразийцев был выше чем у современных (о чем я упоминал в одной из своих заметок в этом блоге).

Трудами известного геномного блоггера Феликса Чандракумара большинство из них было переведено в простой и доступный формат, аналогичный файлам raw data от FTDNA и 23andMe. В GEDMatch можно поиграть с этнокалькуляторами и даже попытаться сравнить свой геном с геномами древних людей.Для этого следует взять из таблицы (кот. видна, если пройти по ссылке) номера, которыми обозначены древние геномы.

Sample Name	Sample Location	GEDMatch	Sex	Y-DNA	Mt-DNA	Approx. Age by authors	My Analysis or Comments
Altai Neanderthal	Denisova Cave, Siberia	F999902	Female			50,000 years
Denisova	Denisova Cave, Siberia	F999903	Female			30,000 years
Palaeo-Eskimo	Qeqertarsuaq, Greenland	F999906	Male	Q1a	D2a1	4,000 years	Palaeo-Eskimo 2000 BC DNA
Clovis-Anzick-1	Montana, North America	F999919	Male	Q-Z780	D4h3a	12,500 years	Matches Living people.
Mal’ta	South-Central Siberia	F999914	Male	R	U	24,000 years	Matches Living people on X Chromosome.
La Braña-Arintero	León, Spain	F999915	Male	C-V183	U5b2c1	7,000 years	Analyzing La Braña-Arintero Ancient DNA
Motala-12	Östergötland, Sweden	F999917	Male	I-L460	U2e1	7,000 years	My Analysis of Motala-12 ancient DNA
LBK	Stuttgart, Germany	F999916	Female		T2c2	7,500 years	Matches Living people
Loschbour	Loschbour, Luxembourg	F999918	Male	I-L460	U5b1a	8,000 years	Matches Living people
Ajvide58	Sweden	F999924	Male	I-CTS772	U4d	5000 years	Ajvide58 DNA Analysis
Gökhem2	Sweden	F999934	Female		H1c	5000 years	Gökhem2 Ancient DNA Analysis
Hinxton-2	Cambridgshire, UK	F999921	Female		H2a2b1	1300 years	Hinxton-2 Analysis
Hinxton-3	Cambridgshire, UK	F999922	Female		K1a4a1a2b	1300 years	Hinxton-3 Analysis
Hinxton-4	Cambridgshire, UK	F999925	Male	R-DF25	H1ag1	2000 years	Hinxton-4 has X-Matches with living people
Hinxton-5	Cambridgshire, UK	F999926	Female		H2a2a1	1300 years	Hinxton5 Ancient DNA Analysis
KO1	Tiszaszőlős-Domaháza, Hungary	F999931	Male	I-L68	R3	5650-5780 cal BC	Analysis of Neolithic KO1 genome
NE1	Polgár-Ferenci-hát, Hungary	F999937	Female		U5b2c	5070-5310 cal BC	NE1 Ancient DNA Analysis
NE5	Kompolt-Kigyósér, Hungary	F999927	Male	C-F3393	J1c	4990-5210 cal BC	Ancient Hungarian Genome NE5 Analysis
NE6	Apc-Berekalja I., Hungary	F999932	Male	C-P255	K1a3a3	4950-5300 cal BC	Analysis of Hungarian genome-NE6
NE7	Apc-Berekalja I., Hungary	F999928	Male	I-L1228	N1a	4360-4490 cal BC	Ancient Hungarian genome — NE7
CO1	Apc-Berekalja I., Hungary	F999930	Female		H	2700-2900 cal BC	Analysis of Copper age genome CO1
BR2	Ludas-Varjú-dűlő, Hungary	F999933	Male	J-M67	K1a1a	1110-1270 cal  BC	Ancient BR2 matches living people
IR1	Ludas-Varjú-dűlő, Hungary	F999929	Male	N-M231	G2a1	830-980 cal BC	Ancient Hungarian genome — IR1
Tyrolean Iceman (ERP001144)	Tisenjoch Pass, Oetztal Alps		Male			5300 years	Pending
Ust’-Ishim	Ust’-Ishim, Siberia	F999935	Male	K-M526	R	45,000 years	Ust’-Ishim matches with living people!
Kostenki14	European Russia	F999936	Male	C-V199	U2b	38,700-36,200 years	Kostenki14 Ancient DNA Analysis

Sample Name	Sample Location	Sex	Y-DNA	Mt-DNA	Approx. Age by authors
Mezmaiskaya Neanderthal	Mezmaiskaya Cave	Female			29,000 years
Tianyuan	Tianyuan Cave, China			R	40,000 years
Afontova Gora-2	South-Central Siberia	Male	R1?	R	17,000 years
Motala-1	Östergötland, Sweden	Female		U5a1	7,000 years
Motala-9	Östergötland, Sweden	Female		U5a2 or U5a1f1a1	7,000 years
Motala-6	Östergötland, Sweden	Male		U5a2d	7,000 years
Motala-2	Östergötland, Sweden	Male	F-P139	U5e1	7,000 years
Motala-4	Östergötland, Sweden	Female		U5a2d	7,000 years
Motala-3	Östergötland, Sweden	Male	I-M258	U2e1	7,000 years
Hinxton-1	Cambridgshire, UK	Male	R-L151	K1a1b1b	2000 years
Ajvide53	Sweden	Female		U4d	5000 years
Ajvide59	Sweden	Male	I-PF3796	U5b2c1	5000 years
Gökhem7	Sweden	Female		H	5000 years
Ire8	Sweden	Male	I-CTS6343	U4d	5000 years
StoraFörvar11	Stora Karlsö, Sweden	Male	I-CTS4077	U5a1f1a	7500 years
Gökhem4	Sweden	Male	CF-M3690	H	5000 years
Gökhem5	Sweden	Female		K1e	5000 years
Ajvide52	Sweden	Male	HIJK-F929	HV0a	5000 years
Ajvide70	Sweden	Female		U4d	5000 years
NE4	Polgár-Ferenci-hát, Hungary	Female		J1c	5050-5290 cal BC
NE3	Garadna, Hungary	Female		X2b	5010-5210 cal BC
BR1	Kompolt-Kigyósér, Hungary	Female		K1c1	1980-2190 cal BC
KO2	Berettyóújfalu-Morotva-liget, Hungary	Female		K1	5570-5710 cal BC
NE2	Debrecen Tócópart Erdõalja, Hungary	Female		HV	5060-5290 cal BC
V2	Vratitsa, Bulgaria	Male		U2e1’2’3	1500-1100 BC
M4	Borum Eshøj, Denmark	Male		B2	1350 BC
K8	Krushare, Bulgaria	Male		R	450-400 BC
NA43	Laguna de los Condores, Peru	Male		B4b’d’e	1000-1500 AD
AusAboriginal	Western Austalian	Male	F-M235	O1a	100 years
NA41	Laguna de los Condores, Peru	Male		L3	1000-1500 AD
P192-1	Svilengrad, Bulgaria	Male		U3b	800-500 BC
T2G2	Stambolovo, Bulgaria	Male		H1c9a	850-700 BC
NA42	Laguna de los Condores, Peru	Male		D1	1000-1500 AD
NA50	Laguna de los Condores, Peru			B4b’d’e	1000-1500 AD
NA47	Laguna de los Condores, Peru			L3	1000-1500 AD
NA40	Laguna de los Condores, Peru			L3	1000-1500 AD
NA39	Laguna de los Condores, Peru	Male		B2	1000-1500 AD
Feld1 Neanderthal	Neander Valley, Germany				42,000 years
Sid1253 Neanderthal	El Sidron cave, Asturias, Spain				49,000 years
Vi33.16 Neanderthal	Vindija cave, Croatia	Female			38,310 years
Vi33.25 Neanderthal	Vindija cave, Croatia	Female
Vi33.26 Neanderthal	Vindija cave, Croatia	Female			44,450 years

В своем блоге Феликс размещает аналитические отчеты по каждому из проведенных анализов, отчеты включают графическое отображения «состава различных геномных компонентов происхождения» каждого из образцов в калькуляторах Gedmatch (включая мой последний калькулятор K23b), фенотипические признаки (предположительный цвет кожи и глаз), возраст на момент смерти и т.д.
Пытаясь ответить на вопрос,  насколько  правдоподобны (в смысле реального генеалогического родства) результаты совпадения сегментов древних и современных людей, Феликс приводит замечательные вычисления оценки правдоподобия совпадений в геномах современных людей и древних образцов. К сожалению, рассуждения замечательные, но вызывающие определенные вопросы, которые я озвучу в другой заметке.

Так или иначе, поставленная Феликсом на поток и практически полностью автоматизированная работа с древними геномами заслуживает безусловного признания, поскольку в силу разделения труда позволяет другими исследователям-любителям полностью сконцетрировать свое внимание на процессе непосредственного анализа полученных данных, вместо того чтобы тратить свои ресурсы на процесс извлечения снипов из «сырых» геномных данных. Благодаря этому разделению труда,  Давид Веселовский из проекта Eurogenes провел ряд замечательных экспериментов с этими данными (включая PCA, Treemix и вычисление генного дрейфа с помощью f3). В основном выводы этих экспериментов повторят то, что было написано в статьях профильных генетиков, за исключением одного интересного вывода на основании графа Treemix, в котором отображено направление процессов обмена генами между различными древними популяциями:

«В отношении Kostenki14, графики  Treemix  подтверждают один из основных выводов работы Seguin-Orlando et al. 2014, согласно которой  главны компонент образца  Kostenki-14  является базальным «предковым» компонентом более поздних европейцев (Basal_Eurasian). Тем не менее, два последних графика показывают, что этот базальный «компонент» не тот же самый «базальный» компонент в геноме неолитического образца из Штутгарта, связанного с базальным евразийским  компонентом, который был описан  в работе Lazaridis et al. 2013″.

Другой геномный блоггер, Сергей Козлов, использовал те же самые данные палеогеномов (взятые с сайта Ф. Чандракумара) для создания замечательных карт, иллюстрирующих количество и интенсивность общих IBD-сегментов палеогеномов и геномов современных популяций.

Я решил не оставаться в стороне и провел собственный анализ PCA и кластеризации популяций по значениям компонентов генетического разнообразия.

Ниже приведены иллюстрации к моему опыту кластеризации собственного генома с геномами древних жителей Евразии. В качестве входных данных алгоритма ward-кластеризации в программе R, я использовал собственные значения 4 векторов главных компонентов (PC) разнообразия. Эти векторы, в свою очередь, были получены путем вычислений в большом массиве (2024 образца) генетических данных (примерно 110 тысяч снип-полиморфизмов) представителей современных и древних популяций. Мой геном (обозначенный как Vadim) представляет собой набор, полученныq в ходе импутации по датасету Human Origin значения снипов информативных с точки зрения эволюционного происхождения, и используется в качестве контрольной группы.

Для начала график PCA, и положение палеогеномов на этом графике.

В аналитической выборке я задействовал снипы геномов высших и низших приматов (дендрограмма выборка укоренена на геноме мармозетки), древних гоминидов (денисовского человека и неандертальцев). Остальное — как я и упоминал выше — представляет собой совокупность снипов современных и древних популяций.

Благодаря характеру выборки и характеру используемых снипов, я могу взглянуть на свое происхождение с наиболее широкой перспективы, позволяющей проследить индивидуальный эволюционный путь от древнейших людей до наших современников.
Можно сказать, что я проделал самое далекое (из всех предыдущих) генеалогическое путешествие в собственное прошлое. Разумеется, без предыдущего выделения обработки образцов древнего ДНК новейшими биохимическими методами, а также публикации данных — это путешствие длинной в сотни тысяч лет не могло бы просто состоятся. Так что огромное спасибо всем биохимикам, генетикам и биоинформатиков работавшим с образцами древней ДНК.

Полученные мной кластерные дендрограммы вышли очень большого разрешения. В силу этого, имеет смысл изучить топологию, структуры и расположение популяционных групп-кластеров в полномасштабном варианте, иначе могут возникнуть интересные вопросы.

Поэтому — я подготовил соответствующие файлы PDF и разместил ссылки на эти файлы для удобного просмотра.

tree1

tree2

tree3

tree4

tree5

tree6

tree7

tree8

tree9

tree10

tree11

tree12

tree13

tree14

tree15

tree16

Здесь их опубликовать не представляется возможным, и по этой причине я ограничу себя размещением тех фрагментов трех вариантов кластерных диаграмм, на которых присутствуют древние образцы.
Забегая вперед, можно заметить, что образцы ДНК древних людей (т.е людей современного анатомического типа — homo sapiens sapiens), строго говоря, разбиваются на три органические суперкластера — древних сибириков (или евразийцев), древних европейских охотников-собирателей, и ранних неолитических европейских земледельцев. В основной своей части состав и топология популяционных кластеров стабилен в разных вариантах, наибольшие видоизменения заметны у тех образцов, чье множество снипов имеет меньшее пересечение с общим набором снипов. Отсюда довольно таки тривиальный вывод: чем меньше общее число снипов — тем больше флуктуаций наблюдается в расположении древних образцов внутри ветвей кластерной дендрограммы.

Кластер древних евразийцев наиболее стабилен (т.к. там всего два древних генома Afontova Gora 2 (AG2) и знаменитый мальчик с сибирской стоянки Malta (MA1); причем оба образца взяты из одного источника данных). Из современных популяций к этому кластеру наиболее органично примыкают различные группы населения центральной Азии — от таджиков до гуджаратов, и от калашей до пуштунов.

Кластер древних охотников-собирателей Европы наиболее неустойчив, и это объясняется прежде всего разным числом снипов в образцах, а также тем что сами образцы взяты из разных исследований. Тем не менее тенденция наглядна — древнейшие европейцы (охотники-собиратели мезолита) наиболее близки по своим аутосомным снипам к жителям современной западной и северной Европы — особенно Британских островов, Скандинавии и Балтийского региона. Практически во всех вариантах прибалтийцы близки к древним жителям Швеции (Готланда), а также мезолитическим образцам La Brana, Motala и Loshbour. Последние также близки к финнам, эстонцам и северным русским. Из более поздних и географически удаленных образцов к ним близки древние образцы из Венгрии неолитического периода, бронозового и железного веков (BR1, NE2 и KO1).

Интересно, что в этот же кластер входят как современные популяции западной Европы (британцы, норвежцы, французы и др.), так и современные жители центральной Европы — чехи хорваты и венгры. Является ли это наследием древних времен (гальштатской общности связываемой с древними кельтами) — трудно сказать. Не этим ли объясняется тот факт, что образцы древних англо-саксов и бриттов (обозначенные здесь как Hixton) иногда кластеризируются с (современными!) венграми, хорватами, иногда с современными англичанами из Кента и корнуэлльцами. При этом некоторые из образцов Hixton остаются близки (в смысле схожести генома) к скандинавам, оркнейцам, шотландцам, и даже литовцам.

Мой собственный «геном» (Vadim) также входит в эту группу, причем в разных вариантах он определенно близок одновременно и древним мезолитическим и эпинеолитическим шведам, а также более поздним образцам из Венгрии (киммерийского мальчика IR1, а также самый «балтийский» из всех древних венгерских обрацов — KO1). Интересно что IR1 («аутосомный геном» «киммерийского » мальчика Y-гаплогрупы N1a из захоронения паннонской культуры бронзового века Mezőcsát примерно 900 год до нашей эры) в первых четырех главных компонентах кластеризируется с моим собственным «аутосомным геномом»). Это наверное объясняет почему мой собственный геном дает хорошие комбинации (fit) к комбинации трапезундских турков и древних жителей Балтийского региона.

Как известно, попгенетики готовят к публикации большую статью, в которой подводятся итоги нескольких лет исследования генофонда представителей древних культуры шнуровой керамики* (известной также как культура боевых топоров) и ямной культуры** (другое название — древнеямная культурно-историческая общность). Безусловно, это исследование обещает пролить свет на некоторые темные места генетических связей жителей этих культур с современным населением Восточной Европы (особенно Польши, Украины, Беларуси и юго-западной части России).

Пока все детали исследования неизвестны, однако благодаря настойчивости некоторых энтузиастов генетической генеалогии (Веселовского и пр.) удалось выяснить, например, что генофонд древние образцы представителей Ямной культуры в рамках формальных тестов (f3 и D-статистик) наилучшим образом аппроксимируются как результат смешения древнего мезолитического населения севера Европы (в работе их представляют карельские образцы, очевидно из известных захоронений Палеострова) и населения, близкого к современным закавказским популяциям (лучший результат дали армяне из Еревана).

Признаюсь, эти сведения приободрили меня. Дело в том, что последние несколько недель я занимался изучением эволюции аутосомного генофонда беларусов (и своего тоже) из недавно опубликованного набора лаборатории Райха (это одна из усеченных версии их знаменитого кураторского набора Human Origin Dataset).
Как и раньше, для анализа я использовал инструменты разработанные программистами той же лаборатории (Admixtools), а также Alder — программу написанную на основе открытого кода Admixtools, и оптимизированную под более детальный анализ процесса смешивания различных предковых групп.

Так вот, до получения сведений о предварительных результатах попгенетиков, я был немного смущен полученной картиной. У меня получилось вот что. С точки зрения формальной оценки (f3-статистки, аналога более известной p-статистки) лучшие пары адмикса для беларусов (с отрицательным значением Z) представляли собой либо комбинацию мезолитического населения Европы (Loshbour) и современного населения современной Анатолии и ближнего Востока, либо комбинацию ‘генов’ неолитических жителей Европы (LBK380, а также современных сардинцев) и современных америндских популяций (происходящих, как нам известно, из восточной Сибири).
Вот начало списка значимых пар:

Mixe Sardinian Vadim -11.811
Sardinian Mixe Vadim -11.811
Karitiana Sardinian Vadim -11.757
Sardinian Karitiana Vadim -11.757
Zapotec Sardinian Vadim -11.638
Sardinian Zapotec Vadim -11.638
Loschbour Georgian_Megrels Vadim -11.599
Georgian_Megrels Loschbour Vadim -11.599
Piapoco Sardinian Vadim -11.482
Sardinian Piapoco Vadim -11.482
Loschbour Turkish_Trabzon  Vadim -11.434
Turkish_Trabzon Loschbour Vadim -11.434
Loschbour Assyrian_WGA Vadim -11.395
Assyrian_WGA Loschbour Vadim -11.395
LBK380 Piapoco Vadim -11.354
Piapoco LBK380 Vadim -11.354
Surui Sardinian Vadim -11.346
Sardinian Surui Vadim -11.346
Loschbour Abkhasian Vadim -11.293
Abkhasian Loschbour Vadim -11.293
Bolivian_LaPaz Sardinian Vadim -11.232
Sardinian Bolivian_LaPaz Vadim -11.232
Loschbour Iranian_Jew Vadim -11.231
Iranian_Jew Loschbour Vadim -11.231

Я выбрал около сотни значимых пар и проверил их достоверность «адмикса) с помощью инструментов D-статистки (qpDstat) в попарном сравнении каждой из значимых комбинаций (начало таблицы):

Vadim Italian_Tuscan : Loschbour Palestinian 0.0293 8.141 best
Vadim Iranian : LBK380 GujaratiC_GIH 0.0245 7.319 best
Vadim Motala12 : Druze Sardinian 0.0125 7.285 best
Vadim Loschbour : Palestinian Albanian 0.0146 7.17 best
Vadim Sardinian : GujaratiC_GIH Iranian 0.0121 7.151 best
Vadim Palestinian : Spanish_Pais_Vasco_IBS GujaratiC_GIH 0.0145 7.126 best
Vadim Egyptian_Comas : Basque_Spanish GujaratiC_GIH 0.0137 7.016 best
Vadim Sardinian : Loschbour Egyptian_Comas 0.0251 6.962 best
Vadim Sardinian : Loschbour Tunisian_Jew 0.0251 6.789 best
Vadim Palestinian : Basque_Spanish GujaratiC_GIH 0.013 6.758 best
Vadim Sardinian : Loschbour Palestinian 0.0237 6.69 best
Vadim Basque_Spanish : Balkar Palestinian 0.0076 6.601 best
Vadim GujaratiC_GIH : Tunisian_Jew Egyptian_Comas 0.0094 6.493 best
Vadim Spanish_Pais_Vasco_IBS : Balkar Palestinian 0.0079 6.458 best
Vadim Loschbour : Druze Italian_WestSicilian 0.0135 6.443 best
Vadim Loschbour : Iranian Albanian 0.0159 6.385 best
Vadim Palestinian : Sardinian Iranian 0.0083 6.344 best

Как видно, лучшая достоверность (обмена генами) у тех пар которые представляют собой комбинацию мезолитических популяций (Loshbour и Motala), популяций Кавказа, южной Европы и центральной Азии.

Это особенно хорошо заметно в тесте f4ratio. Вот например сравнение 2 квадропул, три популяции в каждой из которых идентичны (беларусы, кумыки и Losbour), а четвертая популяция отличается (балкарцы vs. Motala). Результат означает что кроме мезолитического компонента Loshbour (из западной Европы), у беларусов наблюдается эксцесс (28+-0.1%) дополнительного источника мезолитических «генов» (типично для балтийских популяций мезолита вроде Motala)

Vadim Kumyk Loschbour Motala12 : Vadim Kumyk Loschbour Balkar 0.285678 0.096194 2.97

Крайне любопытны и результаты проведенного мной в Alder исследования источников «древного» адмикса у беларусов.
Я выбрал только те пары, в которых амплитуда угасания LD в двух гипотетических популяциях-донорах была сопоставима с амплитудой угасания LD в популяции-реципиенте (т.е у беларусов). Интересно, что только две пары (пенджабцы + Motala) и (иракские евреи + чукчи) дали консистентную попарную подгонку кривой угасания LD с незначительным разбросом амплитуды (15-25%). К слову, комбинация Armenian+Motala-merge (примерно идентичная наиболее устойчивой модели адмикса у жителей ямной культуры) тоже присутствует в списке «успешных» комбинаций, однако кривые угасания LD имеют разную скорость угасания (их амплитуда отличается уже на 55% и поэтому они не консистентны, т.е несовместимы) в попарном режиме сравнения

DATA: success_consistent 0.0042 Belarusian Punjabi_Lahore_PJL Motala_merge 4.49 2.76 2.78 15%
DATA: success_consistent 0.0098 Belarusian Iraqi_Jew Chukchi 4.31 2.2 3.01 25%
DATA: success 0.0065 Belarusian Mongola Motala_merge 4.4 2.64 2.78 28%
DATA: success 0.011 Belarusian Yi Papuan 4.29 2.26 4.66 28%
DATA: success 0.00037 Belarusian Lebanese Papuan 4.98 2.69 4.66 38%
DATA: success 0.041 Belarusian Kusunda Motala_merge 3.98 2.61 2.78 41%
DATA: success 0.013 Belarusian Hezhen Motala_merge 4.25 2.17 2.78 49%
DATA: success 0.037 Belarusian Motala_merge Tu 4.01 2.78 3.13 51%
DATA: success 4.20E-06 Belarusian Kalmyk Motala_merge 5.79 2.36 2.78 54%
DATA: success 0.0086 Belarusian She Motala_merge 4.34 2.58 2.78 54%
DATA: success 0.0019 Belarusian Armenian Motala_merge 4.66 2.14 2.78 55%
DATA: success 0.048 Belarusian Daur Motala_merge 3.94 2.11 2.78 56%
DATA: success 0.0042 Belarusian Motala_merge Miao 4.49 2.78 3.5 59%
DATA: success 0.041 Belarusian Oroqen Motala_merge 3.98 2.28 2.78 59%
DATA: success 0.013 Belarusian Thai Motala_merge 4.25 2.13 2.78 65%
DATA: success 0.043 Belarusian Motala_merge Lahu 3.97 2.78 3.56 71%
DATA: success 0.0049 Belarusian Motala_merge Japanese 4.46 2.78 3.53 72%

Примечательно что для пары Belarusian Armenian Motala_merge  Admixtools датирует смешение 114.67+/-20.5 поколений тому назад. А вот датировка адмикса для двух первых пар (последняя колонка это датировка адмикса
Belarusian Punjabi_Lahore_PJL Motala_merge 4.49 2.76 2.78 15% 142.4+/-27.54
Belarusian Iraqi_Jew Chukchi 4.31 2.2 3.01 25% 43.28+/-9.45 То есь самое позднее 3500 лет до нашего времени.Итак, выводы: в эволюционной перспективе, костяк аутосомного генофонда беларусов составляет субстрат мезолитического генетического компонента Европы, к которому примешиваются два потока — один с юга, с наиболее значимым вливанием во времена неолита (земледельцы из Анатолии и ближнего Востока), другой — видимо более поздний (т.к. он отсутствует у ямников) из Сибири.

---

*Культура боевых топоров, культура шнуровой керамики (нем. Schnurkeramik) — археологическая культура медного и бронзового веков, распространенная на обширных территориях Центральной и Восточной Европы и датированная 3200 г. до н. э./2300 до н. э. — 2300 г. до н. э./1800 г. до н. э. Племена культуры боевых топоров часто считают первыми индоевропейцами на территории Средней Европы
**Я́мная культу́ра (точнее — Древнея́мная культу́рно-истори́ческая о́бщность) — археологическая культура эпохи позднего медного века — раннего бронзового века (3600—2300 до н. э.). Занимала территорию от Южного Приуралья на востоке до Днестра на западе, от Предкавказья на юге до Среднего Поволжья на севере.В рамках ранней версии курганной гипотезы Марии Гимбутас ямная культура связывалась с поздними протоиндоевропейцами.

 

Кластер древних жителей по своей устойчивости занимает промежуточное место между кластерами древних северных евразийцев и западных европейских охотников-собирателей.
В этот кластер, иерархически близкий популяциям Кавказа и ближнего Востока, предсказуемо входят предстаители самых классических популяции южной Европы — от греков и болгар, до басков и сардинцев. Как уже стало обычным, сардинцы кластеризуются с образцом тирольского человека Этци и женщины из линейноленточной культуры («LBK380»). В большинстве вариантов (2 из трех опубликованных) к этой подгруппе примыкают представители древнейших неолитических культур на территории современной Венгрии — CO1, H4, H3, NE5, NE7). Жители бронзового века (на графике они ошибочно обозначены как Europe оказались посередине между раннеевропейскими охотникам-собирателями и земледельцами.

Добавление к выборке древних геномов «усть-ишимца» и «костенковца» позволило пролить свет на некоторые особенности эволюции популяций центральной и восточной части Евразии. В кластерном анализе (вардовская кластеризация) по 4 первым компонентам PCA усть-ишимец у меня получился в одном кластере с киргизами и кажется селькупами. По первым двум компонентам в том варианте рейховского набора популяций, где нет андаманцев Onge — он попадает в один кластер с австралийскими аборигенами.
Думаю, что onge все же ближе, да к тому же во всех калькуляторах у усть-ишимца максимум «генома» приходится на сочетание южно-индийских и юго-восточноазиатских компонентов.  А вот «костенковец» оказывается ближе всего к чувашам и саамам. Что характерно — в предыдущих вариантах, в которых я не использовал костенковца, место костенковца часто занимал AG-2 (Afontova Gora).  Также заметна разница между кластерными схемами PC1-2 и PC-1-2-3-4.В первом случае костенковец в одном кластере с индусами, а во-втором с с чувашами и саамами. Характерно, что восточноевразийские палеогеномы Тяньюань и Усть-Ишим входят в один кластер (их положение не сильно меняется), а MA1 нет.

Скрытые возможности клиентских данных 23andme в плане молекулярной диагностики.

Компания 23andme не нуждается в особом представлении читателям этого блога. Вплоть до конца прошлого года компанию занимало существенный сегмент рынка персональной геномики, ориентированного на предоставление  клиентам информации о генетических медицинских рисках (genetic risks) и генетической генеалогии (genetic origin). Информация о медико-генетических рисках содержалась в ряде сервисов портала компании, а также в доступном для скачивания отчета о генетических рисках и, разумеется, в первичных данных генетического отчета, в котором содержались значимые с точки зреемя медико-генетического диагностирования генетические полиморфизмы (SNP).

Всвязи с известными событиями и последующим за ними предписанием USA Food and Drug Administration (FDA) компании 23andme о запрете выпуска на рынок услуг персонального геномического диагностирования своего «медицинского девайза» (т.е интерпретации медико-генетических рисков развития заболеваний), компании пришлось сузить свою сферу деятельности до оказания генетико-генеалогических услуг.

Несмотря на это досадное обстоятельство, сказавшееся нелучшим образом на динамике увеличения клиентской базы компании,  нужно помнить, что все клиенты сохранили доступ к своим первичным данным тестирования (т.е списку снипов с генотипами). И при вдумчивом, творческом подходе любой человек может не только «вытащить» из этих «cырых данных» важную с точки зрения медицины информацию, но и заменить спомощью полученной информацией результаты более традиционных тестов.

Каковы могут быть варианты использования данных 23andmе не в привычных генеалогических целях, а скажем для получения сведений, который могут впоследствии пригодится для молекулярного диагностирования?

Я приведу пару примеров такого использования.

Определение HLA-фенотипа.

На мембране клеток организма присутствуют продукты генов всех локусов, размещенных на обеих нитях 6-й хромосомы.

 

 

Это означает, что HLA-гены наследуются по кодоминантному типу, т. е. одну хромосому ребенок наследует от матери, а другую – от отца. Как уже упоминалось, совокупность генов, расположенных на одной хромосоме, составляет гаплотип. Таким образом, у человека два гаплотипа и каждая клетка организма несет на себе диплоидный набор антигенов системы HLA, один из которых кодируется HLA-генами матери, а другой – отца. Исключение составляют половые клетки (яйцеклетка и сперматозоид), каждая из которых содержит в своем ядре только по одному гаплотипу.

Антигены гистосовместимости, выявляемые на клетках конкретного человека, составляют HLA-фенотип. Для его определения необходимо произвести фенотипирование клеток индивида. Как правило, “типируются” лимфоциты периферической крови. До настоящего времени в большинстве лабораторий HLA-A. В, С и DR-антигены определяют при помощи серологических методов, в частности, лимфоцитотоксического теста. тот тест основан на способности анти-НLА-антител в присутствии комплемента разрушать лимфоциты, несущие соответствующие антигенные детерминанты. Гибель клеток демонстрируется при помощи добавления трипанового синего. При этом мертвые поврежденные клетки окрашиваются, и под микроскопом учитывается их количество.

Эти тесты часто требуются в ходе стандартных медицинских процедур обследования во время начала беременности, или для изучения этологии аутоимунных заболеваний. Еще более важно определение гистосовеместимости в транплантологии, где типирование HLA-фенотипа  донора является обязательным условием.

Однако, с приходом новых микроматричных технологий опеределния нуклеотидов ДНК и биоинформатических методов рутинной обработки последовательности человеческих геномов , появился дешевая и относительно простая альтернатива классическим серологическим тестам (которые стоят в интервале от 100 до 500 долларов).

Я не буду останавливаться на принципиальном описании процедур, с помощью которых на основании данных 23andme можно с помощью метода «импутирования» определить HLA-фенотип, так как в прошлом году я уже разместил в этом блоге пошаговую инструкцию для выполнения этой задачи.

Впрочем, уже после того, как  я отписался на эту тему здесь,  в департаменте биостатистики Университета Вашингтона был разработан алгоритм HIBAG который принципиально мало чем отличается от алгоритма HLA*IMP (в обеих алгоритмах используется training model, позволяющая определять фенотип HLA по снипам 23andme).  Входные данные программного решения этого алгоритма (язык R) представляют собой формат Plink. А так как в последней версии Plink была включена нативная поддержка формата 23andme, то преобразовать данные 23andme в бинарный формат Plink не сооставит особого труда. Что касается обработки данных в HIBAG, то примерный порядок выполнения команд выглядит следующим образом:

# Load the published parameter estimates from European ancestry
model.list <- get(load(«European-HLA4.RData»))#########################################################################
# Import your PLINK BED file
#
yourgeno <- hlaBED2Geno(bed.fn=».bed», fam.fn=».fam», bim.fn=».bim»)
summary(yourgeno)

# HLA imputation at HLA-A
hla.id <- «A»
model <- hlaModelFromObj(model.list[[hla.id]])
summary(model)
# HLA allele frequencies
cbind(frequency = model$hla.freq)

# SNPs in the model
head(model$snp.id)
# «rs2523442» «rs9257863» «rs2107191» «rs4713226» «rs1362076» «rs7751705»
head(model$snp.position)
# 29525796 29533563 29542274 29542393 29549148 29549597

# best-guess genotypes and all posterior probabilities
pred.guess <- predict(model, yourgeno, type=»response+prob»)
summary(pred.guess)
pred.guess$value
pred.guess$postprob

 

 

Панель метилирования Яско

В последние 10 лет, крупные генетические исследования выявили сотни генных мутаций, которые возникают чаще у аутичных пациентов, чем в общей популяции. Тем не менее, каждый пациент имеет только одну или несколько из этих мутаций, что затрудняет разработку лекарств против болезни. В настоящее время, изучением генетических факторов аутизма занимается большое количество врачей-генетиков,  одним из них является доктор Эми Яско занимается исследованиями генных мутаций у аутистов. Как показали многочисленные молекулярно-генетические обследования и спектрометрия аминокислот, органических кислот и карнитинов, значительное количество аутистов страдает метаболическими нарушениями.  Есть виды аутизма, вызываемые именно этими генетическими нарушениями обмена вещест.

Доктор Эми Яско разработала тест на панель метиляции Яско — тест этот дорогой, стоит 500 долларов, в этой проверяют что-то около 30 генных полиморфизмов (снипов). Выбор снипов в этой панели мотивирован тем, что эти снипы связаны с  определенными генами на «молекулярно-биохимическом пути метиляции» (methyliation pathway),  т.е генами которые влияют на способность организма выполнять ряд ключевых биохимических функций. Наличие генетических дисбалансов,  т.е снипов в пути метиляции, будет ограничивать эффективность пути метиляции.

 

 

К счастью клиентов 23andme, чипсет снипов этой компании включает в себя если не все, то большую часть снипов панели Яско.
Один из проектов, возникший всвязи с неудовлетворенной потребностью клиентов в более развернутой и детальной обработке данных 23andme, Genetic Genie предлагает  условно-бесплатный сервис с помощью которого данные релевантных снипов можно привести к  традиционному виду таблицы с отчетом по панели Яско:

Gene & Variation	rsID	Alleles	Result
COMT V158M	rs4680	AA	+/+
COMT H62H	rs4633	TT	+/+
COMT P199P	rs769224	GG	-/-
VDR Bsm	rs1544410	CC	-/-
VDR Taq	rs731236	__	no call
MAO-A R297R	rs6323	TT	+/+
ACAT1-02	rs3741049	AG	+/-
MTHFR C677T	rs1801133	GG	-/-
MTHFR 03 P39P	rs2066470	AG	+/-
MTHFR A1298C	rs1801131	GG	+/+
MTR A2756G	rs1805087	AA	-/-
MTRR A66G	rs1801394	GG	+/+
MTRR H595Y	rs10380	CC	-/-
MTRR K350A	rs162036	AA	-/-
MTRR R415T	rs2287780	CC	-/-
MTRR A664A	rs1802059	AG	+/-
BHMT-02	rs567754	CC	-/-
BHMT-04	rs617219	AA	-/-
BHMT-08	rs651852	__	no call
AHCY-01	rs819147	__	no call
AHCY-02	rs819134	__	no call
AHCY-19	rs819171	__	no call
CBS C699T	rs234706	GG	-/-
CBS A360A	rs1801181	__	no call
CBS N212N	rs2298758	__	no call
SHMT1 C1420T	rs1979277	__	no call

Несмотря на то, что на выходе клиент получает  готовый частный отчет по тесту Яско, медико-биологическая интерпретация результатов не так уж и проста, и требует определенной интеллектуальной сноровки и общегенетической эрудиции в плане понимания того, какую функцию выполняет тот или иной ген. Строго говоря, при грамотной интерпретации этих результатов, можно самостоятельно составить себе диету из витаминов-пищевых добавок, которые позволяет компенсировать обусловленный генетическим дисбалансом дефицит тех или иных энзимов.Примерный образец интерпретации можно посмотреть здесь